[发明专利]一种检测肿瘤抑制因子p53显性抑制突变的试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种基于酵母基因工程技术在检测和筛选肿瘤抑制因子p53显性抑制突变方面的应用及相应的试剂盒和方法，属于分子生物学检测领域。利用本发明，可以实现对p53的基因突变是否具有显性抑制特性进行快速有效检测。肿瘤抑制因子p53蛋白作为治疗肿瘤的热门靶点，检测在肿瘤的发生过程中p53突变体是否具有显性抑制突变效应对实现肿瘤个性化治疗有不可估量的精准医疗价值。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体地，涉及一种检测肿瘤抑制因子p53显性抑制突变的试剂盒及其应用。

背景技术

p53肿瘤抑制因子在细胞内充当细胞生长和分裂的守卫者。当细胞受到不同的压力的时候，例如DNA损伤，病毒感染，异常的生长信号或者化学药物刺激，都会激活细胞内不同的p53信号传导途径，抑制p53蛋白降解，将p53蛋白稳定在较高的水平，从而发挥P53作为转录因子的作用，激活许多下游基因的表达，使受损伤的细胞停在细胞周期检验点，修复受到损伤的DNA，或者使细胞进入细胞凋亡途径，从而维护细胞基因组的完整，因而p53是最重要的肿瘤抑制基因。

然而，大约一半的肿瘤中会发生p53基因突变，使p53蛋白失去转录活性，使肿瘤细胞不对各条通路上的信号做出反应，因此肿瘤细胞不会在细胞周期滞留或发生细胞凋亡，而是发生恶性的增生。对于没有发生p53基因突变的肿瘤细胞，也往往会通过改变p53通路上的蛋白表达来降低p53通路的敏感性以逃避p53蛋白的调控。

肿瘤抑制蛋白p53在体内以四聚体的形式行使其转录激活功能。在肿瘤发展过程中的一个明显现象是突变型和野生型的等位基因在细胞内会共存很长的一段时期。从理论上讲，当细胞内有既有野生型又有突变型的p53蛋白时，由单一野生型、野生与突变混合型和单一突变型组成的四聚体的比例为1：14：1。所以突变型的p53蛋白很大几率上可以与野生型的p53蛋白结合，对四聚体的转录活性产生影响。在杂合细胞内使野生型p53蛋白不能行使正常转录激活功能的p53基因突变称为显性抑制突变。对p53显性抑制突变的研究最先是基于哺乳动物细胞系统，但哺乳动物细胞系统中野生型和突变型在细胞内的表达量不易控制，也容易受到内源性因素的干扰，导致实验结果不稳定。

1995年Flaman,J.M.等建立了一种在RNA水平上对p53突变进行检测的酵母基因工程技术，通过改造一个内源腺嘌呤基因(ADE2)缺陷型的酿酒酵母菌株，在其染色体上整合了一个含有p53蛋白RGC启动子调控的一个可以表达正常ADE2的报告基因，由此获得酿酒酵母菌株yIG397。当酿酒酵母菌株yIG397转入从肿瘤组织样品中得到的p53cDNA RT-PCR产物和带有缺口的酵母表达载体时，发生同源重组产生缺口修复的p53表达载体，如果该表达载体表达转录功能正常p53蛋白，就会与宿主菌株染色体上的特异性序列(RGC)结合，激活下游报告基因ADE2的表达，从而在选择性培养基平板上形成大的白色菌落。反之如果表达转录功能不正常的p53蛋白，就不能结合并激活ADE2的表达，形成为小的红色菌落。通过红色/白色菌落的颜色就能判断p53基因的状态。由于绝大多数的p53突变都会造成p53蛋白转录激活功能的丧失，所以yIG397系统可以很灵敏地检测到各种类型的p53蛋白功能突变。但其检测方法仍有待改进。

发明内容

为了解决上述技术问题，发明人基于yIG397系统建立一种对p53基因显性抑制效应检测方法。通过将突变型和野生型的p53基因分别克隆到带有色氨酸Trp和组氨酸His基因标记的两个表达载体上，然后在缺少Trp和His的平板上筛选细胞体内有两种p53基因型的转化酵母菌yIG397，通过观察酵母菌克隆的颜色可以判断突变的p53蛋白是否影响了野生型蛋白的转录激活活性，也就是检测p53突变是否具有显性负调控作用。

本发明第一方面提供第一氨基酸标记基因、第一氨基酸标记基因及酵母表达质粒在制备用于检测肿瘤抑制因子p53显性抑制突变的试剂盒中的应用。