[发明专利]一种用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法，其以待测鹿角的基因DNA为模板，采用引物探针组合物进行荧光PCR，根据是否出现扩增曲线以及扩增曲线的Ct值大小判定待测样品是否为正品鹿角或是否含有正品鹿角成分；引物探针组合物包括分别为如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示序列的引物F1、引物R1、探针P1；上述引物、探针也可为将其对应的序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该对应的序列具有相同功能的DNA分子。本发明所述的荧光PCR检测方法在提供真假鹿角的定性检测的同时可以精确定量起始DNA拷贝数，具有简单，快速，高特异性和高灵敏度的特点。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法。

背景技术

中国药典2015年版规定鹿角来源为马鹿和梅花鹿，其饮片规格为极薄片和鹿角粉，无法从性状上加以区分，也没有专属的鉴别方法，造成了造假的重灾区，给鹿角市场造成了巨大冲击。

根据有关文献报道，目前已出现从DNA分子水平对物种加以界定，每个物种的DNA序列都存在有一定的不同，根据序列的SNP位点来设计特异性引物和探针组合可以对物种进行有效鉴别，采用该分子水平的界别可作为传统形态鉴别方法的有效补充。

发明内容

为了克服现有技术所存在的缺陷，本发明提供一种用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法，该检测方法具有高度的特异性与专一性，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率好，具有很高的可行性与应用前景。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种用于鉴别鹿角的荧光PCR检测方法，其包括以下步骤：以待测鹿角的基因DNA为模板，采用引物探针组合物进行荧光PCR，根据是否出现扩增曲线以及扩增曲线的Ct值大小进行判定待测样品是否为正品鹿角或是否含有正品鹿角成分；

其中，所述引物组合物包括：引物F1、引物R1、探针P1；所述引物F1为如SEQ IDNo.1所示序列的单链DNA分子，或为将SEQ ID No.1所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的DNA分子；所述引物R1为如SEQ ID No.2所示序列的单链DNA分子，或为将SEQ ID No.2所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的DNA分子；所述探针P1为如SEQ ID No.3所示序列的单链DNA分子，或为将SEQ ID No.3所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的DNA分子。

上述引物、探针的具体序列如下：

引物F1：5'-CGTCTGAATCGGATTCGAAAT-3'(SEQ ID No.1)；

引物R1：5'-AGTGAGAGCCATTGTTATGAA-3'(SEQ ID No.2)；

探针P1：5'-CACGAGCCACAGAGGCAGCA-3'(SEQ ID No.3)。

进一步地，所述探针P1由荧光基团和荧光淬灭基团修饰；其中，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、JOE、ROX、Cy5，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA。更优选为，所述荧光基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。

进一步地，荧光PCR采用的反应体系为：2×TaqMan Master Mix10μL，引物F1、引物R1、探针P1各0.5μL，DNA模板2μL，双蒸水6.5μL。

进一步地，各引物、探针在反应体系中的浓度均为250nM，DNA模板在反应体系中的浓度为5ng/μL。

进一步地，所述反应体系的配制如下表所示：