[发明专利]一种人源岩藻糖转移酶8的原核表达方法及其产品

说明书

本发明公开了一种岩藻糖转移酶8的原核表达方法及其产品，其中一种岩藻糖转移酶8的原核表达方法，其包括，构建截短型岩藻糖转移酶8，得Fut8ΔTM；构建重组表达质粒；将所述重组表达质粒转化表达宿主菌，表达、纯化；其中，所述Fut8ΔTM的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；一种原核表达的岩藻糖转移酶8，其包括岩藻糖转移酶8核心区氨基酸序列，所述藻糖转移酶8核心区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明利用大肠杆菌成功表达人源截短型Fut8(Fut8ΔTM)，可以在短时间内大量制备该蛋白并且保持其较高的生物活性，有表达效率高、杂蛋白少、易于纯化、廉价方便等特点。

技术领域

本发明属于原核表达技术领域，具体涉及一种人源岩藻糖转移酶8的原核表达方法及其产品。

背景技术

岩藻糖基化是糖蛋白翻译后修饰的一个普遍过程，核心岩藻糖基化即向N-糖链的核心五糖结构(Gn2Man3)还原端第一个N-乙酰葡糖胺上添加一个α1-6连接的岩藻糖，这是一种发生在高尔基体中的岩藻糖基化反应。已有研究表明，核心岩藻糖化的糖蛋白在脑组织中尤其丰富，同时核心岩藻糖化与肿瘤的发展密切相关，使得生物和医学工作者对核心岩藻糖化的研究热度长盛不衰。催化核心岩藻糖化过程的糖基转移酶为岩藻糖转移酶Fut8，该酶是驻留在高尔基体膜上的II型膜蛋白，也是唯一一个能催化形成α1-6岩藻糖苷键的岩藻糖转移酶。

Fut8全称为alpha-(1,6)-fucosyltransferase，最初研究者将其从猪肾脏中纯化出来并取得了活性，这之后一段时间对于Fut8的研究也使用天然提取并纯化的蛋白，来源包括人皮肤纤维母细胞、牛伽玛球蛋白、人胃癌以及肝癌细胞等。现在市面上可以购得商品化的昆虫细胞表达的仓鼠/人源截短型Fut8，主要供应商是Sino Biological公司，然而昆虫表达体系产量较低且耗资高昂，导致生产的蛋白虽然已经商品化但价格十分昂贵，20μg蛋白售价高达2310人民币。

原核表达系统如大肠杆菌产量高，其他干扰蛋白少，是理想的体外大量表达重组Fut8蛋白的体系。至今还未曾有大肠杆菌表达人源Fut8的报道，主要原因是Fut8为高尔基体驻留的哺乳动物膜蛋白，具有糖基化修饰，在原核体系中存在易降解等问题，难以表达纯化。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种岩藻糖转移酶8的原核表达方法及其产品。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种岩藻糖转移酶8的原核表达方法，其包括，构建截短型岩藻糖转移酶8，得Fut8ΔTM；构建重组表达质粒；将所述重组表达质粒转化表达宿主菌，表达、纯化；其中，所述Fut8ΔTM的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

作为本发明所述的岩藻糖转移酶8的原核表达方法的优选方案，其中：所述岩藻糖转移酶8为人源岩藻糖转移酶8，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述表达质粒为pET28a，所述重组表达质粒为pET28a-Fut8ΔTM，所述表达宿主菌为ROSETTA。

作为本发明所述的岩藻糖转移酶8的原核表达方法的优选方案，其中：所述表达，其为使所述表达宿主菌在培养基中培养、诱导；所述纯化，其为超声破碎所述表达宿主菌后通过镍亲和层析进行纯化。

作为本发明所述的岩藻糖转移酶8的原核表达方法的优选方案，其中：所述表达，其为先在37℃、200r/min条件下振荡培养所述表达宿主菌，使OD₆₀₀达到0.6～0.8，降温至16℃继续培养，加入IPTG，在16℃、200r/min诱导培养。