[发明专利]一种来自链霉菌的(R)-选择性苯乙烯单加氧酶

说明书

本发明公开了一种来源于链霉菌Streptomyces sp.NRRL S‑3的新型苯乙烯单加氧酶基因StStyA及其在催化不对称环氧化中的应用。该酶与之前报道的所有苯乙烯环氧化酶相比，对苯乙烯类底物具有相反的选择性，生成的环氧产物为R型，对苯乙烯的ee值为91％，对4‑乙烯基‑2,3‑二氢苯并呋喃的ee值99％。

技术领域

本发明涉及一种新型苯乙烯单加氧酶StStyA的催化功能，经该酶催化苯乙烯类底物可获得R-构型环氧产物，属于应用微生物及酶工程领域。

背景技术

手性环氧化合物是许多手性天然产物、药物的合成前体。随着生物催化技术的发展，以酶催化获得环氧化合物成为关注的热点。其中苯乙烯环氧化酶(StyreneMonooxygenase,SMO，EC 1.14.14.11)可以催化苯乙烯类化合物得到光学纯(S)-环氧化合物，是获得手性环氧化合物的重要方法之一。目前已报道的苯乙烯环氧化酶种类来源单一，大部分来源于假单胞菌属(Pseudomonas)，序列相似度高，酶学性能差异较小，催化活性低；并且催化形成的环氧立体选择性单一，只能生成S构型的环氧产物，限制了其应用范围。只有筛选不同来源且序列相似度低的新酶，才有可能得到新的催化功能。因此，筛选新性能的苯乙烯环氧化酶基因，特别是能生成(R)构型环氧的基因，并发展其在不对称环氧化催化中的应用，具有重要意义。

随着全基因组测序技术的不断发展，NCBI数据库中已经公布了大量的基因序列，为我们提供了丰富的酶资源库，通过数据库挖掘的方法是寻找新型苯乙烯环氧化酶的有效途径。链霉菌在生态系统中发挥着重要的作用，同时也是许多生物活性物质和一些重要蛋白的来源菌株。但目前为止，还没有来源于链霉菌的苯乙烯环氧化酶报道。

发明内容

本发明目的是公开一种来源于链霉菌Streptomyces sp.NRRL S-3的新型苯乙烯单加氧酶StStyA的功能，并提供了该基因构建的重组菌用于催化不对称环氧化反应的方法。

所述新型苯乙烯单加氧酶StStyA的特征是：核苷酸长度为1254bp，序列为SEQ IDNo.1所示，所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

本发明的苯乙烯单加氧酶StStyA基因是通过NCBI数据库挖掘的方法获得，之后通过分子克隆构建相关载体并进行异源表达及生物转化，从而得到了R型环氧产物，ee值在91％-99％之间，尤其对4-乙烯基-2,3-二氢苯并呋喃具有优异的立体选择性，ee值大于99％。

根据本领域公共知识，构建的相关载体、基因工程菌等也属于本发明的保护范围。

本发明涉及的StStyA蛋白与NCBI数据库中已报道序列的相似度见下表，从表中可以看出单加氧酶StStyA在蛋白质水平上的相似度40％，是一个新颖性序列。

本发明的苯乙烯单加氧酶StStyA是通过基因组数据库挖掘的方法获得的：我们以已报道的来源于Pseudomona sp.LQ26的StyA蛋白序列(GenBank登录号ADE62390.1)为参考序列在NCBI数据库中进行BLAST，得到了数量较多的序列，去除已研究过的序列，同时根据酶来源菌株及其序列相似度，我们筛选到该蛋白序列(NCBI登录号为：WP_030740546.1)，并对其序列进行了密码子偏好性优化，优化后的基因(SEQ ID No.1)由上海生工生物工程有限公司合成，并连接至pET28a(+)载体，上、下游限制性内切酶位点分别为BamH I/SacⅠ，获得的质粒命名为pET28-StStyA。

为验证苯乙烯单加氧酶StStyA的功能，将该酶在大肠杆菌中异源表达、纯化，以纯酶进行生物催化反应，可以得到(R)-苯乙烯环氧，ee＝91％，见实施例1。因此，苯乙烯单加氧酶StStyA具有环氧化功能，且生成R-构型产物。