[发明专利]一种细胞内pH的检测方法

说明书

本发明涉及一种细胞内pH测定方法，以i‑motif结构为响应pH元件的，通过在i‑motif连接一对荧光共振能量转移（FRET）荧光对，i‑motif与镧系有机金属框架片层结合淬灭正电荷荧光，随后i‑motif与质子响应后，从片层解离，产生荧光共振能量转移，通过两种荧光的共定位及颜色变化实现细胞内pH的测定。本发明设计i‑motif两端标记一对FRET对，采用镧系金属有机框架纳米层淬灭带正电的TAMRA荧光，保留另一种带负电的FAM荧光。本发明的方法具有较好的光稳定性、抗干扰性，检测具有极佳的时间和空间分辨率，可快速对胞内细胞转染等生理过程中pH变化定量检测。

技术领域

本发明涉及一种测定细胞内pH的检测方法，具体涉及一种基于i-motif响应pH发生形状改变，从而导致探针荧光FRET效应发生改变，通过共定位测定pH的方法。本发明属于单细胞检测领域。

背景技术

细胞内pH在许多胞内活动中发挥重要的用途，如细胞循环、细胞吞噬、细胞凋亡、多重抗药性、离子通道和肌肉收缩等。pH可以调控胞内蛋白的结构和功能，一些细胞器，如溶酶体和线粒体利用质子通道合成ATP从而保持正常的生理功能。胞内紊乱的pH环境不仅会影响细胞内化途径，甚至可以损害神经系统，从而导致一些疾病的产生，如心肌缺血、癌症和阿兹海默症等。因此对活细胞内pH变化的检测对于理解和定量细胞内活动，发现疾病成因具有重要的意义和研究价值。

传统的细胞内pH测定方法有：核磁共振法（中国专利：一种pH测定方法，公开号：CN108195867A。）；微电极法：（中国专利：集光电极和微电极一体的生物神经芯片及其制备方法，公开号：CN108389931A。）；荧光探针法：（中国专利：一种细胞内pH值检测方法，公开号：CN108535169A。）。然而核磁法测定时间分辨率较差，不能进行单细胞pH值测定；微电级法需精准把握电极插入位置，操作难度大；而pH敏感的荧光探针量子产率低、在细胞内易漂泊背景高，并且对细胞有一定毒副作用。以上缺陷限制了这些方法对细胞内pH测定的应用，急需研发一种灵敏、稳定的细胞内pH的检测方法。

DNA在分子识别领域具有独特的优势，其特异性和灵活性使其成为构建纳米级精确自组装结构的基石。i-motif结构是一种对质子敏感的四链螺旋DNA结构，它已经被设计为可利用酸/碱驱动的高效分子马达以及多种分子器件。人工合成的纳米结构可以利用不同的互补杂交、适配体及金属离子结合转换自身的结构，以应对外部环境的刺激。DNA纳米结构具有优良的程序性和生物相容性，从某一方面而言，可以模拟细胞器的细胞内活动。富含胞嘧啶的DNA纳米元件可以作为质子探测器，在酸性条件下，含有胞嘧啶的核苷酸可以形成i-motif结构，即两条平行的C-H·C⁺构成的发夹结构以反向平行的方式相嵌。这种i-motif结构可以对pH变化快速响应，在几个循环中能保持较高的稳定性，并且不会产生有害的副产物。I-motif可以在pH 5-7的范围内改变结构，非常适于检测细胞内pH的改变。因此利用i-motif结构设计可对细胞内pH变化响应的新型检测方法具有较高的研究意义和应用价值。

发明内容

针对现有检测的需求，本发明目的在于提供一种细胞内pH的检测方法，一种以i-motif结构为响应pH元件的细胞内pH测定方法。

本发明目的通过下述技术方案实现：一种细胞内pH的检测方法，以i-motif结构为响应pH元件的，通过在i-motif结构DNA连接一对荧光共振能量转移（FRET）荧光对，i-motif结构DNA与镧系有机金属框架片层结合淬灭正电荷荧光，随后i-motif结构DNA与质子响应后，从片层解离，产生荧光共振能量转移，通过两种荧光的共定位及颜色变化实现细胞内pH的测定，包括以下步骤：

（1）i-motif结构DNA与镧系金属有机框架纳米片层孵育：