[发明专利]一种用于显微注射的松材线虫虫体固定方法

权利要求书

1.一种用于显微注射的松材线虫虫体固定方法，其特征在于，采用琼脂糖水溶液制备固定垫，然后用固定垫固定松材线虫虫体；

具体步骤如下：

1)虫体选择与清洗：挑选健康活跃的松材线虫成虫，滤除线虫悬液中的菌丝杂质，再用无菌水清洗松材线虫2-3遍，浓缩于1.5ml离心管中备用；

2)角质层软化：用SDS-DTT溶液室温黑暗条件下处理松材线虫1h，再用无菌水清洗2-3遍；

3)角质层消解：用pronase E溶液室温处理松材线虫5h，用无菌水清洗2-3遍，放置于无菌水中备用；

4)固定垫制备：配制浓度为1.5％-5.0％的琼脂糖水溶液，用微波炉加热2min，用移液枪吸取50μl液滴快速滴于盖玻片上，迅速用另一盖玻片盖在液滴上，待琼脂糖凝固稳定后，将两个盖玻片分开，让琼脂糖垫完整地黏附于其中一个盖玻片，将黏有琼脂糖固定垫的盖玻片置于65℃干燥箱中干燥处理1h，4℃冰箱保存备用；

5)虫体固定：用睫毛针自水中挑取一条松材线虫成虫，快速放置于制备好的固定垫上，在解剖镜下用睫毛针轻轻下压虫体全身，使虫体表面水膜被固定垫吸收，迅速在虫体全身覆盖上注射油，完成固定。

2.如权利要求1所述的一种用于显微注射的松材线虫虫体固定方法，其特征为，步骤2)中SDS-DTT溶液的原液配方由以下组分组成：200mM DTT、2.5％SDS、20mM HEPES、3％蔗糖，该原液PH为8.0，原液配置完成后需经过0.22μm无菌过滤器过滤处理，再分装保存于-20℃冰箱；SDS-DTT溶液的工作浓度为原液的10％。

3.如权利要求1所述的一种用于显微注射的松材线虫虫体固定方法，其特征在于，步骤3)中pronase E溶液的原液浓度为15mg/ml，原液配置完成后需经过0.22μm无菌过滤器过滤处理，再分装保存于-20℃冰箱；步骤3)中使用的pronase E溶液工作浓度为原液的10％。

4.如权利要求1所述的一种用于显微注射的松材线虫虫体固定方法，其特征在于，步骤4)中琼脂糖水溶液的浓度为2％-4％。

5.如权利要求4所述的一种用于显微注射的松材线虫虫体固定方法，其特征在于，所述琼脂糖水溶液的最佳浓度为3％。

6.如权利要求1所述的一种用于显微注射的松材线虫虫体固定方法，其特征在于，步骤4)中盖玻片长度、宽度和厚度分别为50mm、24mm和0.15mm。

7.如权利要求1所述的一种用于显微注射的松材线虫虫体固定方法，其特征在于，步骤4)固定垫制备过程中不能产生气泡，以免降低对虫体的固定效果。

8.如权利要求1所述的一种用于显微注射的松材线虫虫体固定方法，其特征在于，步骤5)中睫毛针包括针头(1)和针杆(2)，针头的一端与针杆的一端用针座(3)连结和固定，针头采用假睫毛材料制成，针头远离针杆的一端呈弧形设置。

9.如权利要求1所述的一种用于显微注射的松材线虫虫体固定方法，其特征在于，步骤5)中从水中挑取的松材线虫成虫不宜在空中停留时间过长，虫体体表需保留有均匀的水膜，以便为固定垫提供适量水份，更加有效地固定虫体。