[发明专利]TRV-based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法

说明书

本发明提供一种TRV‑based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法。包括：A、根据报春花属植物目标基因，设计引物并扩增出该目标基因的DNA片段；B、将DNA片段连接到pTRV2载体上，得到重组载体；C、将pTRV1、重组载体分别转化农杆菌，所得转化子共同侵染植株。本发明首次证明TRV可成功应用于小报春基因沉默和功能验证，为报春花属植物的基因功能验证奠定了基础。本发明方法简单、研究周期短、无需基因全长和转化体系，获得目的表型效率高，可实现大量基因的快速功能验证。与现有的VIGS体系相比，本发明表型持续时间长，且在植株的不同部位均出现表型变化，对报春花属异型自交不亲和的遗传学研究具有重要意义。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种TRV-based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法。

背景技术

基因沉默(Gene silencing)是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段。病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是一种转录后的基因沉默(PTGS)，由于外源基因的导入，导致植物中与该外源基因一致或高度同源的植物内源mRNA序列的特异性降解。VIGS技术与转基因技术相比具有操作简单和快速有效的优点，是一种较好的用于基因功能验证的反向遗传学工具。

经人工改良后的烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus，TRV)是目前应用最为广泛的VIGS载体。与其他病毒载体相比，TRV载体能有效地将沉默信号传递到植物的生长点，还具有沉默效率高、持续性好、寄主植物病毒症状轻等诸多优点。

小报春(Primulaforbesii)所属的报春花属中约有91％的物种都存在有异型自交不亲和(hetermorphic self-incompatibility)的特性。该性状引起了科学家的兴趣。研究表明，异型自交不亲和是由S位点控制的，S位点上包含至少3个紧密连锁的基因G、P、A，其中G控制花柱高度、P控制花粉大小、A控制花药位置。由于小报春尚未建立起遗传转化体系，限制了对S位点上基因功能的研究。因此，在小报春中建立一套快速、高效的VIGS体系十分重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种TRV-based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种TRV-based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法，包括以下步骤：

A、根据报春花属植物目标基因，设计引物并扩增出该目标基因的DNA片段；

B、将上述DNA片段连接到pTRV2载体上，得到重组载体；

C、将上述重组载体、pTRV1载体分别转化农杆菌，得到的转化子共同侵染植株，经检测具有病毒载体且目的基因表达量显著降低的植株，即为目标基因沉默的植株。

所述报春花属植物包括但不限于小报春。

所述目标基因包括但不限于八氢番茄红素脱氢酶基因(Phytoenedesaturase，PDS)。

例如，所述DNA片段是以小报春cDNA基因组为模板，利用引物F和R，进行PCR扩增得到的；

所述引物F和R分别为：5’-TTAAGGTTACCGAATTCATACCGGCTTGTGAC-3’和5’-GCTCGGTACCGGATCCGCAAATCGATGCACT-3’。(SEQ ID NO:1-2)

第二方面，本发明提供TRV-based病毒诱导的小报春基因沉默的方法，包括以下步骤：

1)重组载体构建：利用基因工程的方法将扩增后的小报春八氢番茄红素脱氢酶(PfPDS)基因片段连接到pTRV2载体中，得到重组载体pTRV2-PfPDS；