[发明专利]一种突变型SSO7d SSB及其应用

说明书

本发明公开一种突变型SSO7d SSB及其应用，本发明所述的突变型SSO7d SSB，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供所述突变型SSO7d SSB的应用，特别是在qPCR领域的应用，可以提高qPCR扩增灵敏度的方法、应用和试剂盒，能够提高qPCR扩增的灵敏度，qPCR扩增平台期荧光信号，提高扩增的特异性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种突变型SSO7d SSB及其应用。

背景技术

qPCR是指在PCR反应体系中加入能够指示DNA片段扩增过程的荧光染料(SYBRGreen等)或荧光标记的特异性的探针(TaqMan Probe等)，通过对PCR过程中产生的荧光信号积累实时监测整个PCR过程，再结合相应的计算机软件对所获得的荧光信号数据进行分析，计算待测样品特定DNA片段的初始浓度。qPCR根据其检测原理可以分为染料法和探针法。染料SYBR Green Ⅰ通过结合到双链DNA的小沟部位发出荧光，染料法没有序列特异性，可以用于不同的模板，不需要设计复杂的荧光探针，缺点是染料可与非特异性产物结合。TaqMan Probe中常见的一种是水解型杂交探针，探针的5'端是报告荧光基团，3’端是淬灭荧光基团，它完整时淬灭基团会淬灭报告基团发出的荧光，从而不发光，水解后发光。PCR的过程中每形成一条DNA链，会水解一条探针，就会产生一个单位信号。探针法只适用于一个目标，可准确定量，但设计繁琐，价格较高。qPCR主要运用于基因表达分析、稀有突变检测、基因分型分析、拷贝数变异分析、药物代谢酶基因分析、 MicroRNA与非编码RNA分析等。在普通科研客户和工业客户端，使用qPCR的市场需求越来越大。

整个qPCR过程可以分为四个阶段：基数期、指数增长期、线性增长期和平台期。指数增长期与扩增效率相关，当指数增长期和横坐标的夹角越接近45度，并且呈现直线时，扩增效率约接近100％，扩增灵敏度越高。平台期的荧光信号与扩增产物的量和染料的结合率相关，平台期越高，说明扩增产物的量越多，SYBR Green Ⅰ与DNA的结合率越高。市面上有很多品牌的qPCR试剂，各个品牌的试剂在用于普通基因扩增时，性能差异不大，但是在用于难扩增基因时，比如：较长片段、高GC片段等，特异性好、扩增效率高、灵敏度高、平台期荧光信号高的试剂具有更好的竞争力。

众多品牌的qPCR试剂在扩增困难基因时存在一些不足，例如：

Ct值偏大的问题：Ct值偏大，检测灵敏度则会下降，很可能会导致假阴性的问题。面对Ct值偏大的问题，解决的方法有很多种，如：加大Taq DNA聚合酶的使用量可一定程度减小Ct值，提高dNTP、Mg²⁺的用量，提高SYBR Green Ⅰ的用量等也能起到一定的作用。

平台期荧光信号较低的问题：平台期荧光信号较低的试剂在检测弱阳性的样本时，可能会出现阴性结果。面对平台期荧光信号较低的问题，解决的方法有很多种，如：加大Taq DNA聚合酶的使用量，提高dNTP、Mg²⁺的用量，提高SYBR Green Ⅰ的用量等。

特异性不好的问题：特异性不好的qPCR结果是不可靠的；面对特异性不好的问题，解决的方法有很多种，如：降低Taq DNA聚合酶的使用量，降低dNTP、Mg²⁺的用量等。