[发明专利]一种人源脐带间充质干细胞的培养及冻存方法

权利要求书

1.一种人源脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)从脐带组织中取华通氏胶部分组织，剪切得到组织块；将所述组织块置于培养皿中，于37℃，5％CO₂的培养箱中倒置培养2～4h，完毕后向所述培养皿中添加细胞培养液，然后置于37℃，5％CO₂的培养箱中，进行第一次原代贴壁培养，培养至第10～12天，先加入TrypLE^TMExpress进行消化，再加入细胞培养液终止消化，收集得到第一次原代种子细胞；

(2)将经过第一次原代贴壁培养后的组织块置于含有细胞培养液的新的培养皿中，然后置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行第二次原代贴壁培养，培养至第6～8天，先加入TrypLE^TMExpress进行消化，再加入细胞培养液终止消化，收集得到第二次原代种子细胞；

(3)将第一次原代种子细胞与第二次原代种子细胞合并，得到总的原代种子细胞；将原代种子细胞接种至含有细胞培养液的培养瓶中，然后置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养，培养至细胞生长至80～90％融合时，先加入TrypLE^TMExpress进行消化，再加入细胞培养液终止消化，然后分种至新的培养瓶中进行传代培养，经数次所述传代培养，得到纯化的人源脐带间充质干细胞；

所述细胞培养液的原料组分为：DMEM+2％血清替代物+2～10ng/mlVEGF+2～10ng/mlBFGF+2mmol/L L-Gln。

2.根据权利要求1所述的人源脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述组织块的大小为1mm³，进行所述第一次原代贴壁培养的组织块与细胞培养液之间的体积比为1:1～1:2；所述TrypLE^TMExpress的加入量为0.02～0.06mL/cm²，所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为2～5min，进行所述消化至细胞呈圆球状，进行所述终止消化的细胞培养液的加入量为0.02～0.06mL/cm²。

3.根据权利要求1所述的人源脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，进行所述第二次原代贴壁培养的组织块与细胞培养液之间的体积比为1:1～1:2；所述TrypLE^TMExpress的加入量为0.02～0.06mL/cm²，所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为2～5min，进行所述消化至细胞呈圆球状；进行所述终止消化的细胞培养液的加入量为0.02～0.06mL/cm²。

4.根据权利要求1所述的人源脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(3)中，所述接种密度为2～3×10⁴个/cm²；所述原代种子细胞与所述细胞培养液之间的比例为2～3×10⁴:0.2；所述TrypLE^TMExpress的加入量为0.02～0.06mL/cm²，所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为2～5min，进行所述消化至细胞呈圆球状；所述终止消化的细胞培养液的加入量为0.02～0.06mL/cm²；所述分种的分种率为1:3～1:6。

5.权利要求1-4任一项所述方法制备得到的人源脐带间充质干细胞。

6.一种权利要求5所述人源脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)向人源脐带间充质干细胞中加入TrypLE^TMExpress进行消化，然后加入细胞培养液终止消化，完毕后离心弃去上清，加入无血清冻存液重悬细胞沉淀，调整细胞密度，得到细胞悬液；

(2)将细胞悬液分装至冻存管中，降温至-80℃，保持24～72h，然后转移至液氮中保存。