[发明专利]一种检测人脂蛋白磷脂酶A2底物及其试剂盒

说明书

本发明目的在于提供一种人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物。本发明另一个目的提供一种检测人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的生化试剂盒。为了实现上述目的本发明提供了一种用于人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物，本发明制备了一种底物，将合成的底物1‑十二酰基‑2（4‑硝基苯戊二酰基）磷脂酰胆碱，溶解于TE缓冲液，并加入含硅油的甘油作为稳定剂。为了进一步提高底物稳定性，本发明经过测试采用三氟丙基甲基硅油。经过测试，本配方底物经过55℃加速破坏稳定性7天，后测试4‑硝基苯酚浓度无上升。而加入人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白后测试4‑硝基苯酚浓度反应曲线效能无下降，实现了人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物稳定性提升。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种检测人脂蛋白磷脂酶A2底物及其试剂盒。

背景技术

脂蛋白相关磷脂酶A2 （lipoprorein-assoeiated phosPhohPaseA2，Lp-PLA2）又称血小板活化因子乙酞水解酶（PAF-AH），是一种炎性细胞分泌的能促使氧化磷脂水解的磷脂酶，是磷脂酶A2（PLA2）超家族中的一员，相对分子质量为45.4kD（441个氨基酸）。Lp-PLA2的基本功能是催化多种氧化磷脂Sn-2位上酰键水解，产生游离脂肪酸和溶血磷脂。此外，Lp-PLA2还能水解血小板活化因子等致炎因子。Lp-PLA2是磷脂酶超家族中的亚型之一，也被称为是血小板活化因子乙酰水解酶，由血管内膜中的巨噬细胞、T细胞和肥大细胞分泌。动脉粥样硬化斑块中Lp-PLA2表达上调，并且在易损斑块纤维帽的巨噬细胞中强表达。Lp-PLA2可水解氧化低密度脂蛋白ox-LDL中的氧化磷脂，生成脂类促炎物质，如溶血卵磷脂和氧化游离脂肪酸，进而产生多种致动脉粥样硬化作用，包括内皮细胞死亡和内皮功能异常，刺激粘附因子和细胞因子的产生。这些物质可通过趋化炎症细胞进一步产生自我强化的循环，生成更多促炎物质。Lp-PLA2的检测有活性法和浓度法两种。活性法主要采用高效液相色谱法、放射活度测定法和酶水解底物法等。高效液相色谱法灵敏度低，易受到血液中各种成分的干扰。放射活度测定法存在试剂的放射性污染、准确度低、重复性差等问题；酶水解底物法常用的底物以1-癸酞基-2-(4-硝基苯戊二酰基)磷脂酰胆碱、1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱、1-癸酰基-2-(4-硝基苯戊二酰基)磷脂酰胆碱，主要反应都是被脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白水解Sn-2 位产生4-硝基苯戊二酞，4-对硝基苯酚丁二酸酐，由于水解产物不稳定进一步分解，产生4-硝基苯酚或对硝基苯酚,导至溶液中4-硝基苯酚或对硝基苯酚对应波长吸光度发生变化，目前上述三种底物都存稳定性较差的问题，自然分解较快，底物必须独立的缓冲液体系统保存到用前进行现稀释现用，否则底物由于自然氧化分解导至本底较高，从而降低检测效率。

发明内容

本发明目的在于提供一种人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物。

本发明另一个目的提供一种检测人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的生化试剂盒。

为了实现上述目的本发明提供了一种用于人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物，本发明制备了一种底物，将合成的底物1-十二酰基-2（4-硝基苯戊二酰基）磷脂酰胆碱，溶解于TE缓冲液，并加入含硅油的甘油作为稳定剂。为了进一步提高底物稳定性，本发明经过测试采用三氟丙基甲基硅油。经过测试，本配方底物经过55℃加速破坏稳定性7天，后测试4-硝基苯酚浓度无上升。而加入人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白后测试4-硝基苯酚浓度反应曲线效能无下降，实现了人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物稳定性提升。

本发明为了更好实施上述方法，公开了一种检测人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的生化试剂盒，该试剂盒包括：稀释缓冲液R1和为人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物R2。使用前述发明中底物作为底物，稀释缓冲液采用pH7.4 磷酸盐缓冲液并加入0.05%吐温-20。对于前述试剂盒进一步优化增加校准品与质控品，校准品与质控品的主要成份为人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白溶液或含人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的血清。

附图说明