[发明专利]一种细菌固定化方法及应用

说明书

本发明公开了一种细菌固定化方法及应用，将LH‑52、TM‑30、EggerthellaYY7918等三种菌包埋到载体微球上，再将此固定化细菌微球装填到层析柱中，制成微生物反应器。本发明通过固定化细菌方法，提高了细菌的利用率，而且可以回收重复使用；通过装入层析柱中，可以用于连续生产。同时，所得到的菌种固定化球生产成本低，菌体附着牢固，菌种具有较高的活性和较长的使用寿命，可高效生产S‑雌马酚。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种细菌固定化方法及应用。

背景技术

大豆异黄酮作为大豆的次级代谢产物，因其广泛的生物活性，近年来引起了国内外学者的高度重视，由于其具有类似雌二醇的结构，又被称为“植物雌激素”。大豆异黄酮包括大豆苷(Daidzin)，大豆苷元(Daidzein)，染料木苷(Genistin)，染料木素(Genistein)，黄豆黄素(Glycitin)，黄豆黄素苷元(Glycitein)等化合物，大豆苷元和染料木素为主要成分。S-雌马酚(S-equol)为大豆苷元的肠道菌群代谢产物，具有类似于大豆异黄酮的生物活性，但生物活性更高，且代谢动力学类型更理性。雌马酚在预防前列腺癌、乳腺癌、骨质疏松以及更年期综合征、心脏病和骨质疏松均有一定疗效。

研究表明，啮齿类动物均可代谢大豆异黄酮产生雌马酚，但对于人类，由于肠道菌群、饮食结构的个体差异，产生雌马酚的能力均不相同。在西方人群中，只有大约30％的个体能够产生雌马酚，而亚洲地区，约有60％的个体可以产生。因此，对于那些无法产生雌马酚的人，其摄入大豆类制品或大豆异黄酮后所产生的健康效应弱于雌马酚产生者。目前，雌马酚的合成途径主要有两种，一种是化学合成法，另一种是生物合成法。在化学合成法中，其合成具有操作复杂，时间周期长，产率不高的缺点；半合成中，多以大豆苷元等为原料，虽然合成步骤简化，产率也有所提高，但产物为消旋体雌马酚，而R-雌马酚的生物活性远远小于S-雌马酚。在生物合成法中，可以将大豆苷元全部代谢为S-雌马酚，转化率高，但目前存在的方法为扩大目标菌群后与大豆苷元厌氧共培养，具有成本高、菌种无法回收、不适合大生产的缺点。

发明内容

本发明目的是提供一种细菌固定化方法，解决上述问题。

本发明的技术方案是：

一种细菌固定化方法，包括步骤：

(1)菌种的富集：在无菌条件下将LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918菌株接种于液体培养基上进行培养，培养结束后，离心收集菌体，洗涤，保存；

(2)菌种的固定化：将所述菌体包埋到载体微球上，获得固定化的细菌球，用无菌水洗涤；

(3)装柱与活化：将所述固定化的细菌球装填到层析柱，获得固定化细菌柱，用溶液进行活化，制成微生物反应器。

进一步的，步骤(1)中所述液体培养基的成份为蛋白胨、牛肉浸粉、氯化钠；所述液体培养基的pH为7.2±0.2；所述培养为在37℃下厌氧培养24-48h；所述离心的速度为10000r/min，时间为10min；所述洗涤为用磷酸盐缓冲液洗涤3次；所述保存温度为4℃。

进一步的，步骤(2)中所述载体微球为海藻酸钠、聚乙烯醇、琼脂、聚丙烯酰胺、壳聚糖、卡拉胶或明胶-戊二醛中的任意一种或多种组合，所述LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918菌株分别包埋到多个载体微球上，或者所述LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918菌株同时包埋到同一个载体微球上。

进一步的，步骤(2)中所述将所述菌体包埋到载体微球上，获得固定化的细菌球，用无菌水洗涤具体为：将2％的海藻酸钠浸泡24h后加热溶解，取2mL的菌液稀释2倍，两者混合均匀，用滴加装置将其慢慢滴入5％CaCl₂溶液，并用玻璃棒不断搅拌，冰浴条件下交联3-6h，获得固定化的细菌球，过滤后，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤所述固定化的细菌球2-3次，放入冰箱4℃保存。