[发明专利]一种细菌固定化方法及应用

权利要求书

1.一种细菌固定化方法，其特征在于，包括步骤：

(1)菌种的富集：在无菌条件下将LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918菌株接种于液体培养基上进行培养，培养结束后，离心收集菌体，洗涤，保存；

(2)菌种的固定化：将所述菌体包埋到载体微球上，获得固定化的细菌球，用无菌水洗涤；

(3)装柱与活化：将所述固定化的细菌球装填到层析柱，获得固定化细菌柱，用溶液进行活化，制成微生物反应器。

2.根据权利要求1所述的一种细菌固定化方法，其特征在于：步骤(1)中所述液体培养基的成份为蛋白胨、牛肉浸粉、氯化钠；所述液体培养基的pH为7.2±0.2；所述培养为在37℃下厌氧培养24-48h；所述离心的速度为10000r/min，时间为10min；所述洗涤为用磷酸盐缓冲液洗涤3次；所述保存温度为4℃。

3.根据权利要求1所述的一种细菌固定化方法，其特征在于：步骤(2)中所述载体微球为海藻酸钠、聚乙烯醇、琼脂、聚丙烯酰胺、壳聚糖、卡拉胶或明胶-戊二醛中的任意一种或多种组合，所述LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918菌株分别包埋到多个载体微球上，或者所述LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918菌株同时包埋到同一个载体微球上。

4.根据权利要求1所述的一种细菌固定化方法，其特征在于，步骤(2)中所述将所述菌体包埋到载体微球上，获得固定化的细菌球，用无菌水洗涤具体为：将2％的海藻酸钠浸泡24h后加热溶解，取2mL的菌液稀释2倍，两者混合均匀，用滴加装置将其慢慢滴入5％CaCl₂溶液，并用玻璃棒不断搅拌，冰浴条件下交联3-6h，获得固定化的细菌球，过滤后，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤所述固定化的细菌球2-3次，放入冰箱4℃保存。

5.根据权利要求1所述的一种细菌固定化方法，其特征在于：步骤(3)中所述固定化的细菌球为LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918细菌球中的任意一种或者多种组合；所述层析柱为玻璃柱、塑料柱或不锈钢柱中的任意一种；所述溶液为葡萄糖溶液或培养液；所述活化时间为5～30h。

6.根据权利要求5所述的一种细菌固定化方法，其特征在于：所述培养液为厌氧培养液，其配方为：磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸铵、氯化钙、硫酸镁、刃天青、L-半胱氨酸、L-抗坏血酸、碳酸钠、牛肉浸粉、蛋白胨、琼脂，所述厌氧培养液的pH为7.5-8.0。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的一种细菌固定化方法在制备雌马酚中的应用。

8.根据权利要求7所述的一种细菌固定化方法在制备雌马酚中的应用，其特征在于，包括步骤：将待降解反应物溶解于缓冲液中，然后输送到所述微生物反应器上，细菌将所述待降解反应物降解，生成产物，收集流出液。

9.根据权利要求8所述的一种细菌固定化方法在制备雌马酚中的应用，其特征在于：所述待降解反应物为大豆异黄酮、大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素、黄豆黄素、黄豆黄素苷元中的任意一种或几种；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液和Tris三羟甲基甲烷缓冲液，所述缓冲液的pH范围为6.4～7.5。