[发明专利]携带1型BVDV-Erns

权利要求书

1.一种携带1型BVDV-E^rns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将GenBank登录号为KC695814.1的人工合成的BVDV1型毒株VEDEVAC E^rns基因序列克隆于pUC57，得到重组质粒pUC57-B1E^rns；以该重组质粒为模板，PCR扩增其E^rns基因片段；所用的引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示；

（2）通过一步定向克隆法，将步骤（1）获得的BVDV1 VEDEVAC株E^rns基因片段克隆至CSFV-C 株感染性克隆质粒pA-FL22，置换CSFV的E^rns基因片段，得到携带BVDV1型E^rns基因的重组CSFV感染性克隆pCSFV-C-B1E^rns；所用的引物序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示；

（3）以CSFV基因2型流行毒株QZ14基因组cDNA为模板，PCR扩增其E2基因的VR1区7-126nt片段；所用CSFV流行毒株E2的VR1序列如SEQ ID NO.5所示，所用的引物序列如SEQ IDNO.6～SEQ ID NO.7所示；

（4）通过一步定向克隆法，将步骤（3）所获QZ14株的VR1片段克隆至步骤（2）所获的pCSFV-C-B1E^rns中，以置换C株E2基因的VR1片段，得到携带BVDV1型E^rns基因和CSFV流行毒株VR1片段的重组CSFV感染性克隆pCSFV-C-B1E^rns-VR1；所用的引物序列如SEQ ID NO.8～SEQID NO.9所示；

（5）用带有突变位点的引物，结合一步定向克隆法，将C株基因组上特定的7个突变位点引入步骤（4）获得的重组感染性克隆中，得到携带BVDV1型E^rns基因和CSFV流行毒株VR1片段以及7个特定突变位点的重组CSFV感染性克隆pCSFV-Cm7-B1E^rns-VR1；所述7个突变位点为T3310G、C3433T、G3531T、A4085G、C8286A、A10332G和A11836C，对应的氨基酸变化为：M979R、A1020V、V1053L、I1237M、L2638I、S3320G和K3821T；所用的引物序列如SEQ ID NO.10～SEQID NO.23所示；

（6）将步骤（5）得到的感染性克隆pCSFV-Cm7-B1E^rns-VR1酶切线性化，体外转录得到重组嵌合CSFV病毒Cm7-B1E^rns-VR1的基因组RNA；

（7）将步骤（6）得到的基因组RNA电转入猪肾细胞PK-15中，通过连续传代的方式获得携带BVDV1型E^rns基因和CSFV流行毒株VR1片段以及7个特定突变位点的重组病毒Cm7-B1E^rns-VR1。