[发明专利]表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建

说明书

本发明涉及生物技术领域，提供了表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，用于猪伪狂犬病和流行性腹泻的防控。其构建方法包括：重组病毒rPRV‑TX‑gE^‑/TK^‑的构建与重组病毒rPRV‑gE^‑/TK^‑‑S1的构建。研制的表达猪流行性腹泻病毒主要保护性抗原基因S1基因的重组伪狂犬病毒疫苗rPRV‑gE^‑/TK^‑‑S1，与常规疫苗相比，不仅可以为这两种猪病的防控提供疫苗候选株，而且可以起到一针防两病的功能。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，提供了一株表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒疫苗候选株，用于猪伪狂犬病和流行性腹泻的防控。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种高度接触性传染病，该病以猪腹泻、呕吐、脱水为特征，不同年龄的猪群均易感染，但对哺乳仔猪的危害最为严重。自2010年以来，我国很多免疫过PEDV经典疫苗的猪群再次爆发流行性腹泻，并且仔猪的发病率和死亡率均明显升高，给我国养猪业造成了严重的经济损失，所以传统疫苗已不足以保护变异株感染的猪群。PEDV S基因编码的S蛋白属于I型膜糖蛋白，是PEDV的主要中和表位区，能够介导机体产生中和抗体，是疫苗研究中的首选靶蛋白，而S蛋白的S1区，包含病毒主要的保护性抗原表位，且它们多属于暴露性抗原表位，是免疫的优势区。

近几年，伪狂犬病毒(PRV)已被开发成强大的载体系统，PRV基因组中存在大量非必需基因，允许同时插入多个外源基因，它们不仅能够表达它们自身的保护性抗原，而且还能表达任何插入的外源基因。因为它们使用宿主机体来复制和表达蛋白质，所得到的外源基因产物在翻译后具有更高的被正确修饰或折叠的可能性。使用PRV基因缺失疫苗的风险很小，安全性高。PRV宿主比较广泛，包括猪，牛，山羊和狗等，这使得可以在多个宿主中靶向动物疾病而无需借助多种载体构建体来表达抗原。天然PRV诱导细胞免疫并引起潜伏感染。因此，rPRV可以在给定宿主中长期维持，从而提供对保护性免疫应答的持续刺激。目前已有多种类型的蛋白在重组伪狂犬病毒中得到表达，如猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白(Lei JL,XiaSL,Wang Y et al.2016)、猪圆环病毒2型(PCV2)的Cap蛋白(杜文娟，刘长明et al.2016)、乙型脑炎病毒(JEV)的PrM-E蛋白(王波,陈焕春et al.2013)等，以表达外源基因的PRV进行免疫，在动物模型小鼠或猪上均可提供特异性的免疫保护。2017年吴旺霞等用当前流行毒株重组伪狂犬病毒，肌肉注射免疫小鼠，发现其能够产生较好的免疫原性。但自2011年以来，我国多个省份接种现有商品化疫苗Bartha-K61株的猪群仍然发生严重的PR，意味着现有疫苗不能对当前流行株提供有效保护，毒株发生了变异。更值得关注的是，在以往的研究里PRV均被认为是不感染高等灵长类动物的，而在2018年却报道出中国上海出现首例人类感染PRV的情况。因此，对PRV的研究和防控越来越受相关学者的重视。

因此，本研究首先构建PRV gE/TK基因双缺失株，随后将PEDV S1基因插入至PRV双缺失株中，旨在构建出能够表达PEDV S1蛋白的重组伪狂犬病毒，为有效防控变异株导致的猪伪狂犬病和猪流行性腹泻病提供二联DIVA疫苗候选株。

发明内容

本研究针对当前流行的伪狂犬病毒变异毒株与流行性腹泻病毒变异毒株构建表达猪流行性腹泻病毒S1基因的重组猪伪狂犬病毒基因工程疫苗，为克服现有疫苗不能有效给当前流行毒株提供良好保护力的问题。

为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案是：

表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，步骤如下：

(一)重组病毒rPRV-TX-gE^-/TK^-的构建：