[发明专利]表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建

权利要求书

1.表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，其特征在于，步骤如下：

(一)重组病毒rPRV-TX-gE^-/TK^-的构建：

(1)合成针对TK基因的鉴定验证引物；

(2)提取rPRV-TX-gE^-基因组DNA和pSKTKRL-GFP载体质粒；

(3)转染与纯化；

(4)双基因报告基因的剔除；

(5)双缺失株rPRV-TX-gE^-/TK^-的鉴定；

(6)抗原纯化；

(7)检测血清抗体；

(8)小鼠免疫攻毒试验；

(二)重组病毒rPRV-gE^-/TK^--S1的构建：

(1)针对PEDV的S1基因设计并合成引物；

(2)提取病毒RNA；

(3)RT-PCR扩增病毒基因片段；

(4)设计引物；

(5)目的片段的PCR扩增与载体pSKTKRL-GFP PCR线性化；

(6)构建重组质粒pSKTKRL-PEDV-S1；

(7)转染与纯化；

(8)重组病毒rPRV-gE^-/TK^--S1中S1基因的鉴定。

2.根据权利要求1所述的表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，其特征在于，所述针对TK基因的鉴定验证引物为：上游引物序列为TK-F，如SEQ ID NO.1所示；下游引物序列为TK-R，如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，其特征在于，所述针对PEDV的S1基因设计并合成的引物为：上游引物序列为PEDV-S1-F，如SEQ ID NO.3所示；下游引物序列为PEDV-S1-R，如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，其特征在于，采用磷酸钙方法进行转染。

5.根据权利要求4所述的表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，其特征在于，细胞总DNA和转移载体的量比例为10:1。

6.根据权利要求1所述的表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，其特征在于，用Cre重组酶作用于带有loxP位点的rPRV-TX-gE^-/TK^-/GFP基因组DNA。

7.根据权利要求1所述的表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，其特征在于，双缺失株rPRV-TX-gE^-/TK^-的鉴定方法为：提取rPRV-TX-gE^-/TK^-基因组DNA，取2μL DNA模板进行PCR扩增，同时以单基因缺失株rPRV-TX-gE^-和rPRV-TX-gE^-/TK^-/GFP基因组DNA作为对照；体系如下：12.5μL 2×Taq Master Mix，引物TK-F、TK-R各0.5μL，SW 9.5μL；反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min 30s，共35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；PCR扩增后，经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。