[发明专利]同时检测尿液枸橼酸和草酸含量的液相色谱串联质谱方法

说明书

本发明提供一种同时检测尿液枸橼酸和草酸含量的液相色谱串联质谱方法，包括制备供试样品和超高效液相色谱‑串联质谱法检测；样本制备采用固相萃取(SPE)方式进行，首先将尿液样本用水进行稀释，然后加入草酸和枸橼酸的同位素标记内标，混合均匀后加入经过活化后的SPE板，然后经过加入氨水的碱性溶液进行洗脱，并在收集后的样本中加入一定浓度的甲酸水溶液，保持其酸性条件，之后将制备完的样本通过色谱仪取样进入色谱质谱系统，通过色谱柱的初步分离；进入质谱中，再根据质谱中产生不同的质荷比检测枸橼酸和草酸。该方法前处理简单，不需衍生、尿样用量较少，可快速、特异的检测尿液草酸和枸橼酸的含量。

技术领域

本发明涉及尿液中枸橼酸和草酸含量的检测方法，具体涉及采用液相色谱串联质谱技术同时检测尿液枸橼酸和草酸含量的方法。

背景技术

泌尿系结石是泌尿外科的常见病之一，在泌尿外科住院病人中占居首位。据文献(Wang W,Fan J,Huang G,Li J,Zhu X,Tian Y,Su L(2017)Prevalence of kidney stonesin mainland China:a systematic review.Sci Rep,7:41630)报道1991—2000年，2001—2010年，和2011年度结石的流行率分别为5.95％，8.86％和10.63％，呈明显增长趋势。泌尿系结石复发率高，据欧洲泌尿系结石预防与评估指南(EAU guidelines forUrolithiasis)报道：一类医生形成泌尿系结石的风险为5％-10％，对结石患者若未进行预防性干预，其5年复发率达50％，10年复发率为高达80-90％，结石的好发年龄在30-50岁，男女之比大约2-3：1。所有这些数据提示我们，泌尿系结石作为一个患病率、复发率高，发病率逐年增长，且主要劳动力处于高风险的疾病，是一个对人类健康具有重大影响的公共卫生问题，不容忽视。

高草酸尿症是是泌尿系结石中的草酸钙结石的重要病因，而枸橼酸是泌尿系结石的重要抑制因子。在中国，尿石中以草酸钙结石最为多见，草酸代谢异常所致的高草酸尿在结石形成上具有重要意义，枸橼酸根离子可以与钙离子配位，抑制草酸钙等尿石矿物的成核和生长，还可以碱化尿液，使酸性类结石如尿酸结石和胱氨酸结石的溶解度增加。准确测定尿液中的草酸和枸橼酸，可以为通过饮食干预或者临床防治提供支持。

目前测定草酸和枸橼酸的方法主要有比色法、高效液相色谱法和离子色谱法。

比色法测定尿液中枸橼酸或草酸含量，方法灵敏度低，特异性差，无法对尿液样品中微量的枸橼酸进行准确的定量分析，且无法同时测定草酸和枸橼酸。

高效液相色谱法测定草酸的方法在前处理时往往需要将样品中的草酸沉淀出来方可测定，对于样品中不能沉淀的枸橼酸则无法同时测定其含量。

还有一些研究采用离子色谱法和毛细管电泳技术，可以同时测定尿液中的草酸和枸橼酸，但在国内因仪器不易获得而受到限制，且该类仪器均无医疗器械注册证。

查阅文献发现有使用液相色谱串联质谱方法测定枸橼酸或者草酸的方法报道(东洁等，液相色谱-质谱串联技术在尿液枸橼酸含量测定中的应用；中华医学杂志，2017,97:3471-3474；东洁等，液相色谱-质谱串联技术定量测定尿中草酸含量的意义，中华医学杂志，2017,97:2043-2046)，但是尚未发现有效液相色谱法串联质谱法同时测定尿液中草酸和枸橼酸的方法及试剂盒。

发明内容

为克服现有技术不足，本发明目的在于建立使用较少样本量、前处理方法简单、同时测定尿液中枸橼酸和草酸的液相色谱串联质谱方法，并制备其相对应的试剂盒。

具体而言，本发明提供同时检测尿液枸橼酸和草酸含量的液相色谱串联质谱方法，包括制备供试样品和超高效液相色谱-串联质谱法检测。