[发明专利]一种基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定引物及方法

说明书

本发明提供一种基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定引物及方法，该方法包括：1)提取杂交柑橘的亲本DNA，并作为模板，使用P29488785F/P29489624R作为引物进行PCR扩增，扩增片段长度858bp，对扩增产物进行Sanger测序，分析亲本间的SNP标记位点；2)提取杂交后代叶片组织的基因组DNA，并作为模板，以P29488785F/P29489624R作为引物，进行PCR获得扩增产物，以P29488785F作为测序引物对扩增产物进行Sanger测序。分析测序峰图中，若在上述SNP位点出现杂峰则为真杂种，完成杂种鉴定工作。本发明步骤简单，可大规模快速鉴定杂种后代。而且，鉴定结果准确可靠。

技术领域

本发明涉及植物间杂交品种鉴定方法，特别涉及一种基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定引物及方法。

背景技术

柑橘遗传上高度杂合，且大多数柑橘主栽品种具有多胚性，使有性杂交较难获得杂种，配抢救能够将真杂种的幼胚保存下来，但大量的珠心胚也存活下来并发育成幼苗，如何从杂交后代中鉴定出真杂种是困扰柑橘育种工作的一大难题。目前，柑橘杂种鉴定主要采用形态学、细胞学、同工酶、随机扩增多态DNA(RAPD)、SSR标记和分子杂交等方法。形态学方法受环境条件影响大，准确性较差；染色体计数不能区别同源与异源融合四倍体；同工酶只能间接推测基因的变化，检测位点较少，且受器官、部位、生理状态、环境条件等影响；RAPD技术受随机引物和模板的结合等诸多因素影响，特异性不强，结果的重复性不太好；SSR技术步骤复杂，且该类标记受杂交过程中重组产生的新的等位基因的限制，DNA复制时的偶然滑动也会导致重复单元数发生改变；分子杂交是体细胞杂种鉴定的有效方法，但对DNA质量要求高，用量大，分析过程繁琐。

SNP分子标记数量多，总体多态信息含量大，在已知亲本的前提下，理论上一个SNP标记就能够用于鉴定杂种。大多数SNP是两等位性，通过Sanger法测序就能够直观地看到杂种后代在亲本间SNP位点的区别，从而鉴定出真杂种。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题是提供一种基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定引物及方法，以达到柑橘杂种快速鉴定的目的。

在Phytozome克里曼丁橘基因组(http://www.phytozome.org)序的第9个scaffold_9:29488746-29491310上，不同柑橘品种在该区段的基因组序列变异位点丰富，适于柑橘的品种鉴定工作。

因此，本发明设计引物P29488785F/P29489624R，正向P29488785F引物的序列是AGGCCAAATTCCTTTCTCG，反向P29489624R引物的序列是TACAGCAGCACCAACAGAG。

本发明的基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定方法，包括如下步骤：

1)、提取杂交柑橘的亲本DNA，并作为模板，使用P29488785F/P29489624R作为引物进行PCR扩增，对扩增产物进行Sanger测序，分析亲本间的SNP标记位点。本步骤是通过比对亲本间的序列差异，得到SNP标记位点；

2)、提取杂交后代叶片组织的基因组DNA，并作为模板，以P29488785F/P29489624R作为引物，进行PCR扩增，以P29488785F作为测序引物对扩增产物进行Sanger测序，观察测序峰，以在上述的SNP位点处是否出现杂峰作为评价真杂种的依据，完成杂种鉴定工作。

作为优选地，步骤2)的鉴定中，在上述SNP位点，真杂种在测序峰图中会出现类似套峰的杂峰，而珠心胚发育而来的幼苗只含有母本的遗传物质，测序峰图则不会出现杂峰。

作为优选地，所述步骤2)中，杂交后代叶片组织的基因组DNA的提取采用微量法：取约3mm×3mm大小的叶片组织，PE管中加液氮研磨，CTAB法提取DNA。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：