[发明专利]一种基于双衍生处理分析甾体激素的检测方法

说明书

本发明属于分析技术领域，具体涉及一种基于双衍生处理分析甾体激素的检测方法。本方法采用甲氧胺作为衍生试剂衍生含羰基的甾体激素，丹磺酰氯衍生含有酚羟基的甾体激素，衍生产物混合后用于液相色谱串联质谱分析，可同时高灵敏检测含有羰基或酚羟基的甾体激素，涵盖雄激素、雌激素、孕激素和皮质激素等。本发明的分析方法具有衍生反应条件温和、检测灵敏度高、线性范围宽等优点。

技术领域

本发明属于分析技术领域，是一种基于双衍生处理分析甾体激素的液相色谱-质谱联用的检测方法，实现同一样品中羰基和酚羟基甾体激素的同时检测。

背景技术

甾体激素是一类极其重要的代谢物，作为信号分子参与调节人体的各种生命活动，在维持第二性征、调控基因转录、调节内分泌与免疫功能等方面发挥着至关重要的作用。目前，检测单个或少量的甾体激素已经在辅助临床诊断中被广泛应用，然而人体内的甾体激素水平个体化差异巨大，且易受到生理周期等因素的影响。因此通过检测单个或少量的甾体激素作出临床诊断或病理分型容易引发误判的风险。对甾体激素代谢组进行定量分析则可以更好地从整体上研究甾体激素网络变化，基于此获得的诊断结果也更加准确可靠。但是，由于甾体激素在人体内含量低，这对于其整个网络的检测带来了极大的困难与挑战。

甾体激素的检测方法主要有免疫分析、气质联用分析(GC-MS)以及液质联用分析(LC-MS)技术。其中LC-MS方法能够同时对多个甾体激素进行高灵敏度特异检测，是一种对整体甾体激素代谢网络进行高通量分析的理想技术。化学衍生化技术是一种常用的样品预处理技术，一方面可以提高目标化合物在液相色谱柱上的保留能力，另一方面可以提高质谱分析的离子化效率，从而提高检测灵敏度。已有文献报道通常对激素中含有的羟基进行衍生，如采用二甲氨基苯甲酸来衍生含羟基的甾体激素，需要催化剂以及较高温度的反应条件，条件比较苛刻，并且衍生反应时间较长。由于大部分甾体激素含有羰基，也可以通过采用羟胺和Girard’s P(GP)等对羰基进行衍生来改善色谱保留及提高检测灵敏度，该反应条件相对比较温和。但这种方法遗漏了少量甾体激素，如雌激素中只含有酚羟基，可采用丹磺酰氯衍生法来提高含酚羟基类甾体激素的检测灵敏度。针对目前甾体激素检测存在的问题为了扩大甾体激素检测覆盖范围，本发明欲建立一种基于甲氧胺和丹磺酰氯双衍生结合LC-MS的高灵敏方法，实现对含羰基和酚羟基甾体激素的同时分析。

发明内容

本发明针对现有方法的不足，建立了一种基于双衍生处理分析甾体激素的检测方法，该方法不仅能提高甾体激素在反相液相色谱上的保留和分离度，而且能提高低丰度甾体激素的质谱检测灵敏度。本发明的分析方法具有衍生反应条件温和、检测灵敏度高、线性范围宽等优点。

本发明采用的技术路线如下：

第一步，血清样品采集和前处理：血清样品在4℃解冻，涡旋混匀后取50-100μL于1.5mL离心管中，加入0.5-1mL二氯甲烷溶液，混合液在振荡仪上涡旋振荡3-5min后，在4℃离心机中以14000rpm/min的速度离心10-15min，最后取下层有机层450-900μL于1.5mL离心管中，在冻干机上冻干。

第二步，甲氧胺衍生含羰基甾体激素：将冻干血清样品5-10μg加入45-90μL浓度为50mM甲氧胺甲醇溶液，涡旋1min后，置于温度为60℃水浴中反应20-40min，取出后置于冰上放置1min。

第三步，丹磺酰氯衍生含酚羟基的激素：另一份冻干血清样品5-10μg加入15-30μL浓度为5mg/mL的丹磺酰氯乙腈溶液和15-30μL 0.15M Na₂CO₃/NaHCO₃水溶液，涡旋1min后，置于温度为60℃水浴中反应20-40min，然后继续加入15-30μL浓度为0.5mol/L的丁胺水溶液，在60℃的水浴中反应30-50min。取出后置于冰上放置1min。

第四步，两种衍生处理后的样品离心处理取上清液待用于液相色谱-质谱联用分析：将上述得到的衍生产物在4℃离心机中以14000rpm/min的速度离心10-15min，留上清液待检测。