[发明专利]一种基于双衍生处理分析甾体激素的检测方法

权利要求书

1.一种基于双衍生处理分析甾体激素的检测方法，其特征在于：选用甲氧胺作为含羰基甾体激素的衍生试剂，丹磺酰氯作为含酚羟基的甾体激素的衍生试剂对样品进行处理，液相色谱-质谱联用检测衍生后的甾体激素，实现同一样品中羰基和酚羟基甾体激素的同时检测，具体包括以下步骤：

第一步，血清样品采集和前处理；

第二步，取第一步得到的处理过的样品，对样品进行衍生处理，具体采用甲氧胺衍生其中的含羰基的甾体激素；

第三步，取第一步得到的处理过的样品，对样品进行衍生处理，具体采用丹磺酰氯衍生其中的含酚羟基的甾体激素；

第四步，将第二步和第三步得到的两种衍生处理后的样品分别进行离心处理，留上清液待用于液相色谱-质谱联用进行分析；

第五步，取第四步中得到的两种上清液，将其混合后进行液相色谱-质谱联用检测分析甾体激素；

所述第三步中，利用丹磺酰氯衍生含酚羟基的甾体激素，衍生反应过程如下：将第一步处理得到的冻干的血清样品5-10 μg加入15-30μL浓度为5mg/mL的丹磺酰氯乙腈溶液和15-30μL的 0.15M Na₂CO₃/NaHCO₃水溶液，涡旋1min后，置于温度为60℃水浴中反应20-40min，然后继续加入15-30 μL浓度为0.5 mol/L的丁胺水溶液，在60℃的水浴中反应30-50 min，取出后置于冰上放置1min，得到衍生处理过的样品。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：第一步中，血清样品在4 ℃解冻，涡旋混匀后取50-100 μL于1.5mL离心管中，加入0.5-1mL二氯甲烷溶液，混合液在振荡仪上涡旋振荡3-5min后，在4℃离心机中以14000rpm/min的速度离心10-15min，最后取下层有机层450-900 μL于1.5mL离心管中，在冻干机上冻干。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：第二步中，利用甲氧胺衍生含羰基的甾体激素，衍生反应过程如下：将第一步处理得到的冻干血清样品5-10μg加入45-90μL浓度为50mM甲氧胺甲醇溶液，涡旋1min后，置于温度为60℃水浴中反应20-40min，取出后置于冰上放置1min，得到衍生处理过的样品。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：第四步中，将第二步和第三步得到的衍生处理过的样品分别在4℃下离心机中以14000 rpm/min的速度离心10-15 min，留上清液待用液相色谱-质谱联用检测。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：第五步中，取第四步中的上清液各60μL混合涡旋1-2 min后进样，进行液相色谱-质谱联用检测分析甾体激素。