[发明专利]基于多重PCR合成寡核苷酸探针的方法

权利要求书

1.基于多重PCR合成寡核苷酸探针的方法，其特征如下：

寡核苷酸探针文库是根据黄瓜基因组序列信息筛选而来，在探针设计过程中，通过双接头的方法将寡核苷酸文库进行分段，利用不同的引物组合通过PCR即可简便快速的得到染色体研究所需的大量寡核苷酸探针。

2.根据权利要求1所述的基于多重PCR合成寡核苷酸探针的方法，是通过以下方法完成的：

1)针对黄瓜4号染色体，以黄瓜‘9930’基因组为参考，通过Chorus软件筛选所需的寡核苷酸文库。

2)使用RepeatMasker去除黄瓜基因组中所有的重复序列，然后将基因组序列分成48nt的寡核苷酸，并弃去含有多于6个核苷酸的均聚物的寡聚物。

3)使用BLAT将每个寡核苷酸与参考基因组比对，选择＞75％相似性的寡核苷酸。

4)利用Primer3保留dTm＞10℃的寡核苷酸以构建探针数据库，从探针数据库中选择与特定染色体或基因组区域相关的探针。

5)筛选出覆盖黄瓜4号染色体(约23.3Mb)的寡核苷酸探针共93396个，平均每Kb约3.8个探针。

6)通过双接头的连接方式将寡核苷酸文库进行分段。

7)将300ng的寡核苷酸文库溶解于300μL的无DNA/RNA水中制成1ng/μL的储备溶液(-80℃储存)，之后将2μL储备溶液与26μL水混合，制备寡核苷酸文库的工作液，储存在-20℃中。

8)PCR中所使用前后引物均使用FAM和TAMRA在引物5’端进行修饰。

9)按照表1中所述体系进行PCR。

表1PCR体系

使用如下PCR程序扩增寡核苷酸片段：95℃3分钟，98℃20秒，54℃15秒，72℃30秒，从步骤2开始进行15个循环，98℃20秒，56℃为15秒，72℃持续30秒，从步骤5开始25个循环，最后温度保持在4℃。PCR反应产物可在进行纯化后直接用作探针。

3.根据权利要求1所述的基于多重PCR合成寡核苷酸探针的方法在进行植物染色体研究的应用。