[发明专利]用于选择性修饰聚合物亚单位以改进基于纳米孔的分析的方法和系统

说明书

本发明提供了用于改善聚合物的基于纳米孔的分析的方法和系统。本公开内容提供了选择性修饰一种预分析物聚合物的一种的一个或多个单体亚单位的方法，其导致聚合物分析物具有被修饰亚单位。所述聚合物分析物在基于纳米孔的系统中产生可检测的信号。所述可检测信号和/或其与参考信号的偏差表明在所述聚合物分析物中所述被修饰亚单位的位置，从而允许在原始预分析物聚合物中那个位置的亚单位的鉴定。

本申请是申请日为2014年9月2日、发明名称为“选择性修饰聚合物亚单位以改进基于纳米孔的分析”的中国发明专利申请No.201480047714.6的分案申请。

对相关申请的交叉引用

本申请要求2012年8月30日递交的美国申请号61/872,406的权益。

关于序列表的声明

与本申请相关的序列表以文本形式代替纸质复印件进行提供，并特此通过引用将其并入本说明书。含有序列表的文本文件的名称是52586_SEQ_LISTING_ST25.txt。文本文件为6KB；创建于2014年9月2日；并且通过EFS-Web与递交本说明书一起进行提交。

政府许可权声明

本发明是以由美国国立卫生研究院授予的资助号R01HG005115下的政府支持进行的。政府具有本发明的某些权利。

发明背景

聚合物分子的快速、可靠且成本节约的分析(诸如核酸和多肽的测序)是研究人员和执业医师的主要靶。确定聚合物的序列(诸如DNA或RNA或多肽中的核酸序列)的能力在鉴定遗传突变和多态性方面具有额外的重要性。已确立的DNA测序技术在过去十年已经有了很大改进，但仍然需要大量的DNA和若干冗长的步骤和努力以得到大于100个核苷酸的连续阅读长度。然后，该信息必须以“鸟枪”形式进行组装，这是费力的事，其非线性地依赖于基因组的大小和构建完整基因组的片段的长度。这些步骤昂贵且耗时，尤其是在对哺乳动物基因组进行测序的时候。

已经将基于纳米孔的分析方法作为传统聚合物分析方法的替代方法进行研究。这些方法涉及将多聚分子(例如单链DNA(“ssDNA”))通过纳米级开口，同时监测信号(诸如电信号)，在聚合物分析物通过纳米孔开口时，所述信号受聚合物亚单位的物理性质的影响。纳米孔最佳地具有使得聚合物仅以依次、单个亚单位顺序(single file order)通过的大小或三维构型。在理论最佳条件下，聚合物分子以使得聚合物的每个离散单体亚单位的通过能够与所监测的信号相关联的速率通过纳米孔。构成聚合物的每个单体亚单位(例如构成ssDNA的核苷酸)的化学和物理性质的差异产生特征电信号，所述特征电信号能够在每个单体亚单位通过纳米孔时鉴定它。由此，迄今为止已被用于分析DNA、RNA和多肽的纳米孔(例如保持在脂双层膜内的蛋白质纳米孔以及固态纳米孔)提供强有力地分析甚至是低拷贝数的聚合物的潜在优点。

但是，完全实现这样的好处仍然存在挑战。例如，在理想测序条件下，每个潜在单体亚单位类型通过纳米孔会产生不同的可检测信号，其能够容易地与任何其他单体亚单位类型通过纳米孔所产生的可检测信号区分开。但是，取决于纳米孔和特定聚合物分析物的结构特征，多个单体亚单位类型常常会产生难以区分的可检测信号。例如，在使用基于耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白A(MspA)的蛋白质纳米孔分析ssDNA中，孔收缩部分中的核苷酸对流过该孔的离子电流(ion current)影响最大。当监测离子电流时，已经发现核苷酸残基腺嘌呤(A)产生最大的可检测电流，而残基胸腺嘧啶(T)产生最低的可检测电流。尽管可以容易地区分A和T残基，但核苷酸残基胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)产生类似地在A和T残基所产生的电流水平之间的电流水平。因此，C和G残基相互之间常常难以区分。在另一个实例中，分析蛋白质孔α-溶血素中的ssDNA产生甚至更为压缩的信号，其中对于所有四个核苷酸残基类型存在信号重叠，这使得碱基判定(base-calling)不确定。