[发明专利]一种比色和电致发光双模式适配体传感器及测定马拉硫磷的方法

权利要求书

1.一种比色和电致化学发光双模式适配体传感器，其特征在于，该传感器有相对独立的比色和电致化学发光两种信号传导模式；抗坏血酸既作为电致化学发光模式抑制剂，又作为比色模式中催化剂；磁性纳米晶团簇CuFe₂O₄ MNCs负载马拉硫磷适配体和碱性磷酸酶ALP。

2.根据权利要求1所述的一种比色和电致化学发光双模式适配体传感器，其特征在于，抗坏血酸由碱性磷酸酶的水解反应生成。

3.根据权利要求1所述的一种比色和电致化学发光双模式适配体传感器，其特征在于，电致化学发光模式中，以三维金凝胶/鲁米诺纳米复合物修饰玻碳电极。

4.根据权利要求3所述一种比色和电致化学发光双模式适配体传感器，其特征在于，制备方法如下：

（1）将50.0 μL、1 mg/mL盐酸多巴胺滴入96孔板中，并在37 ℃下孵育30 min；

（2）氮气氛干燥后，将20.0 µL、0.1 µmol/L互补链和30.0 µL戊二醛加入到96孔板中，37 ℃下孵化1h；以10.0 µL、10 µmol/L 的6-巯基己醇封闭非特异性结合位点；

（3）移取20.0 µL Apt/ALP-Au NPs@CuFe₂O₄ MNCs于96孔板中，37 ℃下孵化1h；

（4）将不同浓度的马拉硫磷滴涂于上述构建的适配体传感器的表面，在37 °C下孵化1h，再用pH 7.4的PBS缓冲液冲洗；

（5）将200.0 µL含100 mmol/L L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐的Tris-HCl溶液加入到上述96孔板中，酶水解反应35 min，得酶水解液；

所述的Apt/ALP-Au NPs@CuFe₂O₄ MNCs，制备方法如下：

（1）称取0.3197 g CuCl₂·2H₂O和1.3500 g FeCl₃·6H₂O溶于30.0 mL乙二醇，剧烈搅拌10 min；再加入2.700 g NaAc和0.75 g聚乙二醇4000，剧烈搅拌混合物30 min，然后密封在高压釜中；

（2）将高压釜加热至200 ℃并保持8 h，然后冷却至室温，用超纯水离心洗涤并重新分散，得CuFe₂O₄ MNCs；

（3）取1.0 mL、10 mg/mL CuFe₂O₄ MNCs与9.0 mL、0.25 mmol/L Au NPs混合，搅拌过夜后离心洗涤，得到Au NPs@CuFe₂O₄ MNCs复合材料；

（4）将300.0 µL、100 µg/mL碱性磷酸酶ALP、200.0 µL 1 µmol/L马拉硫磷适配体Apt加入到125.0 µL、16.3 mg/mL Au NPs@CuFe₂O₄ MNCs溶液中，孵化过夜，离心洗涤并重新分散到1.0 mL Tris-HCl中存储备用；

所述的三维金凝胶/鲁米诺纳米复合物修饰玻碳电极，制备方法如下：

（1）在搅拌下，将1.2 mL 0.1 mol/L的硼氢化钠加入到40.0 mL含0.25 mmol/L的柠檬酸钠·二水和0.25 mmol/L的HAuCl₄的混合溶液中，老化6 h，得到Au NPs；

（2）将1.5 mL、0.1mol/L盐酸多巴胺加入到Au NPs的溶液中震荡30 min，然后静置沉淀72 h后离心洗涤得到三维金凝胶；

（3）移取5.5 mL上述三维金凝胶溶液与0.5 mL、60 mmol/L鲁米诺混合震荡过夜后，离心洗涤，得三维金凝胶/鲁米诺纳米复合物，用超纯水重新分散；

（4）移取5.0 μL三维金凝胶/鲁米诺纳米复合物分散液，滴涂到已处理好的玻碳电极表面，晾干备用。

5.权利要求1所述的比色和电致化学发光双模式适配体传感器用于检测马拉硫磷，其特征在于，方法如下：

（1）电致化学发光模式：取权利要求4中步骤（5）所得酶水解液20.0 µL，加入到含有0.25 mol/L H₂O₂的pH 7.4 PBS缓冲溶液的电解池中，以三维金凝胶/鲁米诺纳米复合物修饰玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，在0~0.7 V电位区间内进行循环伏安扫描，光电倍增管300 V，记录得到的光强；

（2）比色模式：取权利要求4中步骤（5）所得酶水解液180.0 µL，加入到含0.1 mol/LHCl和1.0×10^-4 mol/L亚甲基蓝的混合溶液中，置于暗处5 min；目视比色进行定性和半定量分析；同时用紫外可见光谱仪测定吸光度。