[发明专利]一种快速检测黄牛MLLT10基因CNV标记的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种快速检测黄牛MLLT10基因CNV标记的方法及其应用，基于实时荧光定量PCR技术，以黄牛基因组DNA为模板，利用特异性PCR引物扩增黄牛MLLT10基因拷贝数变异区，并扩增黄牛BTF3基因部分片段作为内参，最后利用2^‑ΔΔCt方法计算并判定个体的拷贝数变异类型。本发明提供的方法为建立黄牛MLLT10基因拷贝数变异与生长性状之间的关联奠定了基础，检测方法简单、快速，可用于加快黄牛分子标记辅助选择育种工作，便于推广应用。

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种检测黄牛MLLT10基因CNV标记的方法，该方法利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术，以BTF3基因作为参照，根据-ΔΔCt值确定个体MLLT10基因拷贝数变异类型。

背景技术

标记辅助选择(marker-assisted selection)中，要么知道所要评定的性状有某些QTL(主效基因)存在，并且能直接测定它们的基因型(例如通过候选基因分析发现的QTL)，要么虽不能测定它们的基因型，但知道它们与某些标记的连锁关系(例如通过标记-QTL连锁分析发现的QTL)，可以测定这些标记的基因型，这时就可将这些信息用到个体的遗传评定中，提高精确性。

拷贝数变异(Copy number variation,CNV)是一种常见的遗传多态性，主要表现为亚显微水平的缺失和重复，是由基因组发生重排而导致的，一般指长度为1kb以上的基因组大片段的拷贝数增加或者减少。CNV常用的检测方法主要分为两类：一类主要用于在全基因组范围内检测未知CNV，包括基因组芯片和高通量测序技术；另一类主要用于定点检测或验证已知CNV。

其中芯片方法主要包括比较基因组杂交芯片(Comparative GenomicHybridization,CGH)和SNP芯片，在比较基因组芯片中寡核苷酸探针芯片因其具有高精度、高灵敏度、样本需要量小等特点，被广泛使用。SNP芯片在检测时不需要对照样本，通过被检测样本内SNP信号强度来进行分析。其主要优点是能同时提供拷贝数和基因型信息，还可以显示杂合性缺失。但是SNP芯片上的探针在基因组分布不均衡，很多复杂区域探针设计困难。因此，SNP芯片在检测CNV时有一定的局限性。随着新一代测序技术的成熟，直接通过重测序来检测基因组结构变异已经成为当前最有效的检测手段。与杂交技术相比，利用测序技术来检测CNV具备很多优势：提高了CNV的分辨率；可以确定CNV的边界；可以检测出个体CNV的绝对拷贝数；对于结构变化复杂的CNV也有较高检测效力。但这种方法成本较高。

在检测已知CNV的各种方法中，qPCR是使用比较广泛的一种技术。该方法操作简单，敏感性高，速度快。PCR中选取单拷贝的基因，作为内参基因，然后利用2^-ΔΔCt的方法判定个体的拷贝数变异类型以及相对拷贝数。

截止目前，MLLT家族基因少部分在医学领域得到研究，有研究表明MLLT10基因与皮下脂肪组织(subcutaneous adipose tissue,SAT)具有强烈的相关性。但未见到关于检测黄牛MLLT10基因拷贝数变异的实时定量PCR的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测黄牛MLLT10基因CNV标记的方法及其应用。

为达到以上目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测黄牛MLLT10基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：

以待测黄牛血液基因组DNA为模板，以引物对P1及引物对P2为引物，通过实时荧光定量PCR分别扩增MLLT10基因的拷贝数变异区域以及作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定黄牛个体MLLT10基因的拷贝数变异类型；所述的拷贝数变异区域位于牛MLLT10基因(GeneID:519864)参考基因组序列Chr 13:23206001-23210800，共4800bp。