[发明专利]一株敲除胞外核酸酶ExeP的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一株敲除胞外核酸酶ExeP的谷氨酸棒杆菌，该菌株中胞外核酸酶基因ExeP失活，所述的谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032，所述胞外核酸酶ExeP的基因序列如SEQ ID NO.1所示，失活后的胞外核酸酶ExeP的基因序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过敲除敲除胞外核酸酶ExeP，减少胞外DNA的降解，加强了谷氨酸棒杆菌的成膜能力，利用本发明构建的敲除胞外核酸酶ExeP的谷氨酸棒杆菌发酵产脯氨酸，提高了脯氨酸连续化发酵的产量，缩短了发酵周期。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及到一株敲除胞外核酸酶ExeP的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

生物膜广泛存在于自然界，在生物膜形成过程中，细菌自身分泌产生的的胞外聚合物(EPS)是生物膜形成的物质基础，具有分层分布的特点，对细菌的粘附及聚集特性起到了关键作用。从化学组成而言，胞外聚合物主要由蛋白质、多聚糖、胞外DNA等构成。新研究表明eDNA对于EPS结构的完整性及生物膜的三维结构起到关键作用，不仅影响EPS关键组分的空间分布，而且直接决定生物膜的最初形成过程。eDNA作为 EPS的关键组分，对于维系生物膜的空间稳定性具有十分重要的作用，eDNA在生物膜形成过程中强化了细胞聚集，与蛋白质、多聚糖等相互结合缠绕，起到了“脚手架”和“蜘蛛网”的作用，进一步促进了生物膜的结构完整性。

谷氨酸棒状杆菌作为重要的工业菌株，其成膜能力非常弱，难以连续化发酵，了解和阐明eDNA对生物膜的重要作用有可以运用到谷氨酸棒状杆菌上，弄清eDNA与生物膜中其他胞外分泌物的关系可以为我们筛选改造谷氨酸棒状杆菌的基因，可以促进谷氨酸棒状杆菌生物膜的形成。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株敲除胞外核酸酶ExeP的谷氨酸棒杆菌，以促进谷氨酸棒杆菌生物膜的形成。

本发明还要解决的技术问题是提供谷氨酸棒杆菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述谷氨酸棒杆菌的应用。

为了解决上述问题，本发明采用的技术方案如下：

一株敲除胞外核酸酶ExeP的谷氨酸棒杆菌，该菌株中胞外核酸酶基因ExeP失活，所述的胞外核酸酶基因ExeP失活是指胞外核酸酶基因ExeP不能正常表达，或者胞外核酸酶基因ExeP不能表达得到具有胞外核酸酶功能的蛋白质。

胞外核酸酶基因ExeP被为细胞外内切核酸酶，编码细胞外内切核酸酶的产生，可以分解胞外DNA。

其中，所述的谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。

其中，所述胞外核酸酶ExeP的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，失活后的胞外核酸酶ExeP的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

上述敲除胞外核酸酶ExeP的谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建ExeP基因敲除片段，所述基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示；

(2)将ExeP基因敲除片段克隆到敲除质粒上，得到重组质粒；

(3)将重组质粒转化谷氨酸棒杆菌，筛选得到胞外核酸酶基因ExeP失活的基因工程菌。

步骤(2)中，所述的敲除质粒为pk18mobsacB。

步骤(3)中，所述的谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。

上述敲除胞外核酸酶ExeP的谷氨酸棒杆菌在微生物发酵中的应用在本发明的保护范围之内。

上述敲除胞外核酸酶ExeP的谷氨酸棒杆菌在制备脯氨酸中的应用在本发明的保护范围之内。