[发明专利]三维培养间充质干细胞来源外泌体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种三维培养间充质干细胞来源外泌体及其制备方法与应用。所述三维培养间充质干细胞来源外泌体的制备方法包括：将间充质干细胞接种在所述三维支架材料上，并进行贴壁培养，之后分离获得三维培养间充质干细胞来源外泌体。本发明还公开了所述三维培养间充质干细胞来源外泌体在制备能够治疗阿尔兹海默病的药物中的应用。本发明利用三维支架材料作为载体培养间充质干细胞，可以提高间充质干细胞来源外泌体的产量，调控外泌体内含物成分及其功能，尤其是在阿尔兹海默病治疗中，可以有效抑制淀粉样蛋白沉积和改善记忆认知能力。

技术领域

本发明涉及一种三维支架材料及其在间充质干细胞来源外泌体制备中的应用，以及所获三维培养间充质干细胞来源外泌体在制备治疗阿尔兹海默病的产品中的应用，属于生物医学材料技术领域。

背景技术

阿尔兹海默病是一种最常见的老年痴呆症状，表现为认知水平和记忆功能下降。2018年全球大概有5,000万患者，而这一数字将于2050年提高至15,200万。阿尔兹海默病主要病理特征是细胞外淀粉样蛋白沉积形成老年斑和细胞内Tau蛋白过度磷酸化形成神经原缠结，最终造成神经元功能的丧失及死亡。目前，临床上尚无有效的治疗手段或药物能够抑制淀粉样蛋白沉积、神经元死亡以及病人记忆功能的衰退。

随着干细胞技术的不断发展，发现干细胞可以自我更新并分化为各种中枢神经系统的细胞，为阿尔兹海默病治疗带来希望。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类成体干细胞，广泛存在于多种组织和器官中，并具有低免疫原性的特点，被认为是最具治疗潜力的种子细胞。研究表明，间充质干细胞能够抑制淀粉样蛋白沉积、缓解神经炎症、恢复胶质细胞功能并最终改善记忆缺陷。然而，进一步研究发现间充质干细胞在体内分化较低且并不稳定，移植的间充质干细胞大部分发生了凋亡，并未直接参与组织再生。因此认为间充质干细胞在阿尔兹海默病症治疗方面的作用主要是通过旁分泌功能实现的。利用间充质干细胞培养条件培养基而不是细胞本身移植可以达到衰减淀粉样蛋白沉积的体内外研究，进一步证实了上述观点。另外，间充质干细胞移植在阿尔兹海默病治疗中还存在着一定的毒副作用和安全性问题。

外泌体是一类直径为30-150nm的双层膜纳米囊泡，是间充质干细胞分泌物的重要组分之一。外泌体通过运输蛋白质、mRNA、miRNA等活性生物分子，实现细胞-细胞之间的通讯，并参与调控生理过程和疾病的发生。

研究发现间充质干细胞来源外泌体能抑制淀粉样蛋白沉积并改善记忆缺陷；更重要的是，来源细胞所处微环境的变化决定了外泌体内含物的组成，将对阿尔兹海默病的治疗具有特殊作用。例如，在可释放一氧化氮的聚合物作用下，间充质干细胞来源外泌体中表皮生长因子和miR-126水平有所增加，进而改善了小鼠下肢缺血症状(Biomaterials.2017.133:70-81.)；Cui,G.,等人发现缺氧处理的外泌体能够提供额外的miR-21，进而改善小鼠的认知功能和病理症状(FASEB J.2018.32(2):654-668.)。另一方面研究者验证了生物材料的表面拓扑结构以及维度等因素能够明显提高间充质干细胞的旁分泌功能(Biomaterials.2017.141:74-85.；Biomaterials.2017.140:103-114.)，但仅限于因子水平的检测研究，并没有深入了解生物材料对间充质干细胞来源外泌体的影响及其功能。

三维支架培养中细胞的表现与传统二维培养基底明显不同，三维培养中细胞-细胞、细胞-基质相互作用能够更好地模拟机体微环境。另外，三维支架材料的物理特性，如弹性模量、表面拓扑结构等，在细胞粘附、增殖、迁移分化以及旁分泌功能调控上发挥了关键作用。目前为止，尚未有三维支架材料是否能够调控间充质干细胞来源外泌体功能影响阿尔兹海默病治疗的研究报道。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种三维培养间充质干细胞来源外泌体及其利用三维支架材料作为载体的制备方法，以克服现有技术中的不足。

本发明的另一目的还在于提供前述三维培养间充质干细胞来源外泌体在制备治疗阿尔兹海默病的产品中的应用。