[发明专利]来自异源供体的单核细胞的共分化

说明书

本发明公开了一种用于产生源自两种不同异源供体的非耗竭未成熟树突细胞(DC)的方法。在该方法中，提供异源白细胞的混合物，其中所述异源白细胞已从至少两种不同的异源供体中获得。随后，将异源单核细胞从异源白细胞的混合物中分离出来。最后，从所述分离的异源白细胞中生成非耗竭未成熟DC。

技术领域

本发明涉及一种用于产生非耗竭未成熟单核细胞衍生的人类树突细胞(dendritic cell,DC)的方法。

背景技术

传统的癌症疗法，例如手术、放疗和化疗，往往不足以治疗患者，且常常导致严重的副作用。免疫疗法已显示出有望成为一种替代疗法，且具有较少的副作用。

现在公认，免疫系统具有细胞，特别是CD8+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)，它可识别并潜在地杀死肿瘤细胞。然而，一个主要的问题是，这些T细胞的杀伤能力要么不被诱发，要么只是在癌症患者体内被微弱地诱发。一种可能性是，肿瘤抗原呈递和由树突细胞(DC)引起的共刺激不足，而二者是用于引发癌症患者体内的功能性和肿瘤特异性T细胞免疫的“自然佐剂”。

现有的癌症免疫治疗策略主要集中在负载抗原的自体患者衍生的DC，其已被分化和在体外负载抗原。这种方法的基本前提是，通过DC的体外操作而提供的效率和控制，产生具有很强抗原呈递和协同刺激能力的DC。T细胞反应的质量取决于这些自体DC在引流淋巴结方面以MHC限制的方式而向T细胞呈递肿瘤抗原的能力(DC和T细胞必须来自同一个体)，从而产生肿瘤特异性T细胞反应。

单核细胞衍生的自体DC是在试验性研究中最普遍使用的DC，因为它有可能从通过白细胞分离法而收集到的外周血白细胞中获得十亿个单核细胞，这是一个费力而又耗时的过程，其中白细胞从循环血液中分离。随后可使用一些方法来富集单核细胞，且这些方法中的两个，即淘析和抗体/小珠分离，也可在符合药品生产质量管理规范(GoodManufacturing Practice,GMP)指导方针的前提下实施。

单核细胞随后被培养在添加有GM-CSF和IL-4的培养基中达4-7天，使其被分化成未成熟DC，这些未成熟DC的特征在于，它们在随后的某些类型活化因子的刺激下，具有产生大量促炎性趋化因子和细胞因子的突出能力(Sallusto等，Eur J Immunol，1999.29:1617；Napolitani等，Natuer Immunology 2005.6:769)。在接种疫苗之前，被刺激的DC通常与相关的肿瘤抗原一起被预脉冲，且活化达1-2天。然而，对这类以DC为基础的疫苗所发生的免疫反应往往较弱，且临床反应很少是彻底而持久的。

人们对体外产生的自体DC在其已被注射之后的命运和功能知之甚少。在人类的设置中，最近对注射疫苗DC的迁移模式进行了体内跟踪，且值得注意的是，所注入的DC不到5％到达引流淋巴结，而大多数DC保留在注射部位。这些困于本地的疫苗DC迅速丧失其活力，且随后被所添加的抗原呈递细胞清除。

现已有数据表明，在有限时段内(即6至18h)已被体外活化的注射疫苗DC成为促炎性(pro-inflammatory,PI)DC，其通过作为纯局部免疫佐剂，能够在体内间接地引物天然CD8+T细胞。所注入的PI-DC的佐剂功能严格地依赖于其在施用时(在除去活化因子后)某些DC和NK细胞添加趋化因子的继续分泌。这样的PI-DC也表达/分泌在接种疫苗部位诱导所添加的内源性NK细胞和DC活化的因子。与PI-DC相反，已在临床试验中被普遍应用的长时间(即24h)活化DC的特征在于其“耗竭”状态(Langenkamp等，2000)，因此其在被施用时无法分泌所期望的趋化因子和DC活化因子。