[发明专利]一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法

权利要求书

1.一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：在无菌条件下采集肺叶样本，将气管切成片状组织，得到肺泡上皮组织的组织碎片；

S2：配置用于细胞贴壁生长的活化基底，涂布在培养皿上并进行固化；

S3：在固化的所述活化基底上设置接种位置，并将所述组织碎片接种到所述接种位置上，使所述组织碎块贴附在培养皿底壁；

S4：向接种后的组织碎片中添加活化培养液，置于混合氧气内进行活化培养；

S5：将经过活化培养的组织碎片转移到新的涂布有活化基底的培养皿中，添加原代培养液，在CO₂培养箱中进行原代培养，培养8～10d后将组织碎片转移至新的涂布有活化基底的培养皿中，重复原代培养过程若干次，得到原代细胞；

S6：将所述原代细胞以每瓶10⁴个细胞的浓度进行接种，采用经过照射的3T3细胞作滋养层，加入传代培养液进行悬浮培养，得到传代细胞。

2.如权利要求1所述的人肺泡上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤S1的具体方法如下：

在无菌条件下采集肺叶样本，浸入L-15培养液中，切开气管，并切成1cm²的正方形片状，得到肺泡上皮组织的组织碎片。

3.如权利要求1所述的人肺泡上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤S2的具体方法如下：

配置用于细胞贴壁生长的活化基底，取1ml涂布在6cm培养皿底面，置于36.5℃的CO₂培养箱内放置2h，使所述活化基底固化，并加入5ml活化培养液。

4.如权利要求1所述的人肺泡上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤S3的具体方法如下：

在培养皿底部表面边缘用解剖刀刻画出1cm2的正方形，并去除其中的活化基底，形成接种位置；将所述组织碎片上皮面向上移入所述接种位置中，去除活化培养液，在室温下静置3～5min，使组织块贴附在培养皿底壁。

5.如权利要求1所述的人肺泡上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤S4的具体方法如下：

向接种后的组织碎片中添加3ml DMEM培养液，放入可控气室，向气室中注入混合氧气，将气室置于摇床上，在36.5℃、10r/min条件下培养24h，然后更换HB培养液和混合氧气，继续培养6～8d，每2d更换一次培养液和混合氧气；

所述混合氧气为50％O₂、45％N₂以及5％CO₂。

6.如权利要求1所述的人肺泡上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤S5的具体方法如下：

S5.1：用新的10cm培养皿凸部活化基底，并对活化基底底部进行真空吸引，用解剖刀刻画新的接种位置，并将组织碎片转移至新的培养基中，添加无菌DMEM培养液，室温下放置3～5h；

S5.2：加入10ml LHC-9培养液，在湿化的5％CO₂培养箱中进行原代培养，每3～4d更换培养液；

S5.3：培养8～10d后，将组织块移入新的涂布有活化基底的培养皿中，重复步骤S5.2若干次，得到原代细胞。

7.如权利要求1所述的人肺泡上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤S6的具体方法如下：

S6.1：用PBS缓冲液对所述原代细胞进行洗涤，并用消化液进行消化，消化结束后，用培养液悬浮细胞并计数；按照每瓶10⁴个的接种量接种到新的培养瓶中；

S6.2：加入5～10倍数量的经过Co60照射的3T3细胞，混合均匀后加入传代培养液，置于37℃下培养15～30天，即得到传代细胞；

3T3细胞的处理方法如下：

(1)用含有10％小牛血清的DMEM培养基培养3T3细胞，48h后更换培养液，继续培养15～30天；

(2)通过60Gy Co60照射、对3T3细胞进行灭活；

(3)用所述消化液对灭活的3T3细胞进行消化，用不含血清的DMEM培养基清洗两次，并进行混悬。