[发明专利]一种GII.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法及用途

说明书

一种GII.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法及在作为检测NoV抗原或NoV的IgG或IgM试剂盒的用途，制备包括1)，免疫原的制备，扩增或设计合成P序列，构建PGEX‑4T‑1‑P重组表达载体，利用大肠杆菌表达系统表达NoVGⅡ.4型P蛋白，经GST亲和层析柱纯化，制备P颗粒；2)，动物免疫，3)杂交瘤细胞株的制备和筛选，将小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞通过PEG1500融合，制备杂交瘤细胞；通过酶联免疫吸附试验检测细胞上清以筛选特GⅡ.4型诺如病毒的抗体；4)杂交瘤细胞的克隆化。本发明制备的抗NoV单克隆抗体具有针对NoV特异性强，敏感性高，稳定，适合用于制备NoV检测试剂盒。

技术领域

本发明涉及生物医学领域的病毒免疫学检测技术领域，特别是涉及一种GII.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法及用途。

背景技术

诺如病毒(norovirus，NoV)是引起病毒性胃肠炎最主要的病原体，全世界近90％的病毒性胃肠炎流行都是由NoV引起的，在发展中国家每年至少有20万5岁以下儿童因NoV引起的腹泻而丧生。NoV是单股正链RNA病毒，属杯状病毒科，无包膜、无折叠，衣壳呈二十面体对称结构。其全基因组编码三个开放阅读框(ORF)，其中ORF2编码主要结构蛋白VP1，由S区和向外凸起的P区域两部分组成。NoV具有基因多样性，基于VP1序列分为5个基因组(GI-GV)，其中感染人类的主要为GⅡ基因组。

NoV的基因和抗原性具有丰富的多样性。研究表明，GII是全球多数国家病毒性急性肠胃炎暴发及散发最主要的病原体，基因型优势株为GII.4，占60-80％以上。自20世纪90年代中期首次确认GII.4型毒株导致绝大部分胃肠炎暴发后，GII.4型毒株一直为全球优势流行株。NoV变异速度快，每2-4年GII.4型NoV进化形成新的基因簇，取代原有基因簇成为优势流行株而造成多次全球规模的大流行，1995年至今，由不同变异株引起了7次全球NoV暴发流行，分别是95/96-US株(1995-2002年)、Farmington Hills株(2002-2004年)、Hunter株(2003-2006年)、2006a株(2006-2008)和2006b株(2006-2009)、Osaka株(2007-2008)、NewOrleans株(2009-至今)和Sydney株(2012-至今)，因此，有必要研制对同型和异型NoV兼具免疫保护作用的高效疫苗。

病毒受体是公认的引发病毒感染宿主细胞的起始步骤和关键因素之一。受体对于宿主非常关键，且感染性病原体往往为了适应不同的受体表型选择性进化。研究发现，人类组织血型抗原(HBGA)是NoV的病毒受体，HBGA是一类具有高度多态性的糖类抗原，广泛分布于人体的上皮细胞和红细胞表面、腺上皮组织及其分泌物中。研究发现不同基因型的流行率与其结合宿主谱一致，其中GII.4由于其可以结合所有的A、B、O分泌性抗原，成为优势流行株。

衣壳蛋白VP1是NoV抗原主要决定簇，并负责识别宿主受体。衣壳蛋白VP1可以划分为2个区域，分别为衣壳蛋白中间的S区域和向外突出的P区域。P区域又可分为P1和P2两个主要的亚区。P1亚区与抗原性有关，而P2亚区被认为与细胞受体结合有关。NoVP区域在大肠杆菌中表达时，可形成P二聚体、12聚体小颗粒和24聚体P颗粒，这三种不同P聚合体都具有免疫原性并且可识别HBGA受体。P颗粒具有与VLP类似的立体空间结构，及天然结合宿主受体特性和高免疫原性。

诺如病毒缺少细胞培养模型，也没有小动物模型，这给疫苗和抗病毒药物的研究带来了很大的阻碍。目前对NoV的诊断方法主要是免疫电镜法(IEM)、放射免疫法(RIA)、酶联免疫试验(ELISA法)、实时荧光定量-聚合酶链反应(realtime-PCR)等，其中夹心ELISA法，用单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)捕获粪便中的病毒抗原，mAb具有交叉反应小，灵敏度高，特异性强的特点，在许多疾病的诊断中已得到广泛应用。

因此，本领域技术人员致力于开发具有良好临床应用前景的抗诺如病毒药物。

发明内容