[发明专利]一种磁微粒化学发光免疫检测CA125表面Tn抗原的试剂盒及其制备方法

说明书

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种磁微粒化学发光免疫检测CA125表面Tn抗原的试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括偶联有CA125抗体Fab片段的磁分离试剂，含有唾液酸酶的能够识别Tn抗原的生物素‑凝集素试剂，链霉亲和素‑生物素‑碱性磷酸酶偶联试剂；磁分离试剂特异性结合CA125抗原，生物素‑凝集素可特异性识别CA125抗原表面的Tn抗原，链霉亲和素‑生物素‑碱性磷酸酶偶联试剂可特异性结合生物素‑凝集素试剂实现对检测信号的放大，唾液酸酶水解Tn抗原表面与唾液酸相连的糖苷键，释放唾液酸使Tn抗原暴露，提高检测的准确率、灵敏度和线性范围。本发明试剂盒特异性高、灵敏度好，可实现全自动化测试。

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种磁微粒化学发光免疫检测CA125表面Tn抗原的试剂盒及其制备方法。

背景技术

卵巢癌于妇科恶性肿瘤发病率位居第三，仅次于子宫颈癌和子宫体癌，但病死率位居首位。近数十年来，尽管大量科研工作者致力于卵巢癌的研究，但仍未明显改善该类患者的生存率。癌抗原125(cancer antigen 125，CA125)最初于1981年由Bast等发现并命名，为单克隆抗体OC125所识别的抗原表位，且于1984年由Klug等首次使用放射免疫分析技术对其进行定量检测，并设定CA125的正常范围＜35U/ml。CA125一方面为妇科常用的血清肿瘤标志物，另一方面为卵巢癌病情监测及随访最重要的肿瘤标志物。

研究显示，卵巢癌组织能合成并分泌大量CA125，血清中CA125水平与肿瘤大小，及肿瘤组织CA125染色程度呈正相关，因此其水平能够很好显示机体的肿瘤负荷，从而作为卵巢癌临床诊断及术后随访的重要指标。但除卵巢癌外，血清中CA125具有多源性，其在成人组织中分布包括苗勒氏管上皮(输卵管内膜、子宫内膜、宫颈内膜)；结膜和角膜上皮；支气管上皮及支气管粘膜下腺；腹膜、胸膜以及心膜等间皮组织。此种现象致使除卵巢癌外的其他诸多良恶性疾病均会出现血清CA125浓度升高的现象。1997年，有学者报道了克利夫兰临床中心300余名血清CA125浓度大于65U/ml患者的临床病症，其中74.3％为妇科恶性肿瘤，另有10.2％为非妇科恶性肿瘤，及13.1％为良性疾病患者。较多妇科良性疾病，如子宫内膜异位症等，近年来呈现较高的发病率，其临床表现，如盆腔包块、盆腔积液等与卵巢癌的临床表现类似。此等现象均为临床诊断带来较多困难，并给良性疾病患者带来不必要的精神负担。鉴于此，若能找寻良恶性来源CA125分子间的结构差异，并对其进行准确分型，可明显提高临床诊断的准确率。

CA125序列中存在较多潜在的糖基化位点，因此它是一种高度糖基化的粘蛋白，其糖链可达整个分子质量的20％～70％，而糖基化程度也是造成CA125分子异质性的原因之一。恶性肿瘤的产生常伴随糖链合成、降解，以及连接相关分子的异常变化，从而导致其最终合成的蛋白出现异常糖基化状态。卵巢癌CA125分子可表现出O-糖基化障碍，O-糖链是以GalNAc与肽链上的丝氨酸/苏氨酸连接形成，而卵巢癌CA125常出现O-糖链合成障碍，结果形成短的O-糖链，表现为T抗原或Tn抗原。通过检测CA125表面的Tn抗原可进一步区分患者血清中CA125的良、恶性来源。

凝集素可用于特异性糖链的分析，其所识别的糖链结构常位于分子表面，且为糖链参与免疫识别的关键位点，因此对生物学分析具有重要意义。而且凝集素本身是一类不具有催化活性、不改变糖链构型及定位的非抗体类糖结合蛋白，其与糖链的结合具有高度结构、连键方式，及空间构型的特异性。有研究者已证明卵巢癌来源的CA125抗原表面具有因糖链高度特异化而形成的Tn抗原，一种凝集素VVA与该抗原具有高度特异性识别作用，例如专利CN201210283107.2公开了一种检测CA125表面Tn抗原的基于ELISA原理的试剂盒，该试剂盒利用了凝集素VVA识别CA125表面Tn抗原，但其本身存在诸多不足和缺陷，共表现在以下几个方面：

1)该专利是基于ELISA技术的微孔板的非均相反应体系相较于基于磁微粒化学发光的均相反应体系，其选择性、灵敏性，及反应速度均不及后者；