[发明专利]一种提高重组枯草芽孢杆菌合成N-乙酰氨基葡萄糖效率的方法

说明书

本发明公开了一种提高重组枯草芽孢杆菌合成N‑乙酰氨基葡萄糖效率的方法，属于遗传工程技术领域。本发明以枯草芽孢杆菌自身功能膜微域FMMs为空间支架，以双质粒系统形式将FMMs定位功能结构域SPFH domain分别与氨基葡萄糖‑6‑磷酸合成酶GlmS和氨基葡萄糖‑6‑磷酸乙酰化酶GNA1进行融合表达，并通过一对工具小肽CC‑Di‑A和CC‑Di‑B调控GlmS与GNA1之间的化学计量比。在摇瓶发酵过程中，对照菌株的乙酰氨基葡萄糖的产量仅为1.97g/L，而G1:N2的乙酰氨基葡萄糖产量增加至6.15g/L，是对照菌株的3.12倍。本发明的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种提高重组枯草芽孢杆菌合成N-乙酰氨基葡萄糖效率的方法，属于遗传工程技术领域。

背景技术

在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛添加在药物和营养膳食中来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。

目前，乙酰氨基葡萄糖的生产原料主要为酸解虾壳或蟹壳中的甲壳素，然而，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为GRAS(Generally Regarded as Safe)安全级别。

前期研究发现，利用细胞自身的支架构建多酶复合体系统可以在不加重细胞代谢负担的前提下显著提高N-乙酰氨基葡萄糖的产量。然而，研究过程中发现我们所构建的支架-多酶复合体系统存在代谢溢流。因此，提高一种减少代谢溢流的支架-多酶复合体系统，对于提高N-乙酰氨基葡萄糖产量有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种提高重组枯草芽孢杆菌合成N-乙酰氨基葡萄糖效率的方法，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌自身的功能膜微域FMMs作为空间支架，融合表达FMMs定位功能结构域SPFH domain、氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS与氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1，并以工具小肽CC-Di-A和CC-Di-B分别调控氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS与氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1，使GlmS与GNA1的化学计量比为1:1～3；所述CC-Di-A的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述CC-Di-B的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的第二个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，以枯草芽孢杆菌自身的功能膜微域FMMs作为空间支架，通过双质粒系统表达FMMs定位功能结构域SPFH domain、氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS与氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1；以工具小肽CC-Di-A和CC-Di-B分别调控氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS与氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1，使GlmS与GNA1化学计量比为1:1～3；双质粒系统中包括A质粒和B质粒，A质粒表达SPFH domain、氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS和CC-Di-A，B质粒表达氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1和CC-Di-B。

在本发明的一种实施方式中，以枯草芽孢杆菌BSN6作为出发菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述A质粒为pHT01，所述B质粒为pP43。

在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的编码基因的核苷酸序列如NCBI-Gene ID:938736所示。

在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶的编码基因的核苷酸序列如NCBI-Gene ID:179437所示。

在本发明的一种实施方式中，所述小肽CC-Di-A的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。