[发明专利]转基因玉米MON89034品系定量检测试剂盒及数字PCR检测方法

说明书

本发明提供了转基因玉米MON89034品系定量检测试剂盒及数字PCR检测方法，具体地本发明提供了基于数字PCR法获得了转基因玉米MON89034品系的定量数字PCR检测方法，该方法中使用品系特异引物探针组和内源基因特异引物探针组进行双重数字PCR检测，实验结果表明本发明的方法检测灵敏度可达到0.1％，线性范围为0.1％‑100％，符合转基因定量检测的需要。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种转基因玉米MON89034品系定量检测试剂盒及数字PCR检测方法。

背景技术

转基因检测通常是针对外源DNA或外源蛋白的检测。核酸在生物细胞中含量相对稳定，在产品加工中也相对不容易被破坏，而且核酸检测方法灵敏度高、操作简便，成为主流方法。常用的核酸检测手段包括等温扩增、普通PCR、双重PCR、实时荧光定量PCR(Real-time Fluoresence Quantitative,qPCR)、数字PCR(digital PCR，dPCR)等。

qPCR可以筛选转基因特异DNA片段，但大多数的qPCR在转基因检测方法的应用还停留在定性阶段，主要是因为，1)对于转基因产品中低丰度转基因成分定量检测，qPCR方法容易受到食品饲料中PCR抑制物影响，降低qPCR扩增效率，因此qPCR方法的重复性差,灵敏度较低；2)更重要的是作为一种相对定量方法，qPCR依赖标准品和标准曲线进行定量，但是目前可获得的国家有证DNA标准物质非常缺乏，导致实际检测中标准曲线可溯源性和可靠性有待提高；3)qPCR方法标准依据也以定性为主，如SN/T 1204-2003《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》，SN/T 2668-2010《转基因植物品系特异性检测方法》，SN/T 1196-2012《转基因成分检测玉米检测方法》等，仅有《GB/T 19495.5-2004转基因产品检测核酸定量PCR检测方法》是定量方法标准。

dPCR的核心原理是样品极限分配和单分子扩增反应，首先利用微珠液滴或者高通量微量芯片，将样品极致分配，直到每一个样品单元含有的阳性模板商量为1或者0，然后经过PCR扩展之后，对阳性样品单元进行检测和数据统计，根据泊松分布理论，得到DNA浓度定量结果。随着近年来dPCR的迅速发展，其在转基因成分定量检测领域表现出了巨大的潜能。

dPCR定量检测转基因产品的灵敏度高，特异性好，但目前国内外dPCR玉米转基因定量检测的方法研究较少。因此，本领域技术人员致力于开发灵敏度高、特异性好，使用简单、方便的转基因数字PCR检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转基因玉米MON89034品系定量检测试剂盒及数字PCR检测方法。

在本发明的第一方面，提供了一种用于转基因玉米MON89034品系定量检测数字PCR法的引物对组，所述引物对组包括第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:2所示的反向引物。

在另一优选例中，所述引物对组还包括第二引物对，所述第二引物对包括如SEQID NO.:7所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:8所示的反向引物。

本发明的第二方面，提供了一种用于转基因玉米MON89034品系定量检测的探针组，所述探针组包括：如SEQ ID NO.:3所示的针对转基因玉米MON89034品系特异基因序列的探针。

在另一优选例中，所述探针组还包括：如SEQ ID NO.:9所示的针对内源基因Adh-1保守序列的特异性的探针。

本发明的第三方面，提供了一种用于转基因玉米MON89034品系定量检测的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的PCR引物对组。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针组。