[发明专利]一种DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒及其应用方法

权利要求书

1.一种DC-CIK细胞诱导活化的试剂盒，其特征在于，包含盒盖和盒体，该盒体内部设有一个海绵托，该海绵拖上设有六个固定孔，该六个固定孔内分别放置有内容调制CIK细胞因子激活液IL-2的试剂瓶、内容调制CIK细胞因子激活液CD3的试剂瓶、内容调制CIK细胞因子激活液IFN-γ的试剂瓶、内容调制DC细胞因子激活液IL-4和GM-CSF混合液的试剂瓶、内容调制DC细胞因子激活液TNF-α的试剂瓶、内容无血清培养液的试剂瓶。

2.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于，IL-2的浓度为500-1500U/ml，CD3的浓度为30-120ng/ml，IL-4和GM-CSF混合液的浓度为100-800U/ml，TNF-α的浓度为100-800U/ml，IFN-γ的浓度为400-1600U/ml。

3.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于，IL-4和GM-CSF混合液的浓度为500U/ml；和/或，IL-2的浓度为1000U/ml。

4.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于，CD3的浓度为100ng/ml。

5.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于，TNF-α的浓度为500U/ml。

6.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于，IFN-γ的浓度为1000U/ml。

7.一种DC-CIK细胞的诱导活化试剂盒的应用方法，用于DC-CIK细胞诱导活化的试剂盒，该试剂盒包括调制CIK细胞因子激活液IL-2、调制CIK细胞因子激活液CD3、调制CIK细胞因子激活液IFN-γ、调制DC细胞因子激活液IL-4和GM-CSF混合液、调制DC细胞因子激活液TNF-α、无血清培养液，其特征在于，该应用方法包括如下步骤：

抽外周血100ml，收集于四联血袋；

血液预处理:将所采集100ml外周血，置于2支50ml的离心管中,离心(500-1000g,10-35min),上清转移至50ml离心管待处理备用，下部的细胞作密度梯度离心分离PBMC(外周血单核细胞)用；

细胞的分离：血液预处理获得的下层细胞用生理盐水1:1稀释，混匀。将40ml淋巴细胞分离液等量均分放入50ml刻度离心管，将离心管中已稀释的细胞悬液等量均分沿管壁缓慢匀速加入离心管，滴加过程中注意用力均匀，避免破坏分离液-白细胞界面的完整性，离心(500-1000g,15-45min，离心机升降速调到最慢)，离心后，管内液体分为三层，移液管弃去上层约15ml液体后吸取上、中层界面处白色云雾层狭窄带(即所需PBMC，约5ml)放入离心管，生理盐水洗2次(600g,8min)后弃上清，从试剂盒中取出无血清细胞培养基，每管40ml无血清细胞培养液重悬细胞分离所获得的PBMC；

接种细胞：将40ml PBMC细胞悬液加入细胞培养瓶1，置饱和湿度、37℃、3.0％-10％CO₂条件下培养。2小时后，收集悬浮细胞，并用无血清培养液调整细胞浓度到1X10⁶/ml,在其中加入IFN-γ培养(400-1600U/ml)。24小时后，从试剂盒中取出细胞因子激活液IL-2(500-1500U/ml)和CD3(30-120ng/mL)各40μl，用于CIK细胞诱导；向细胞培养瓶1中的贴壁细胞加入20ml DC细胞诱导因子IL-4和GM-CSF(100-800U/ml)混合液，用于DC细胞诱导培养；

培养至第三天，补加无血清细胞培养液40ml，40μl细胞因子激活液IL-2(500-1500U/ml)至培养瓶使培养液总体积为80ml；

培养至第四天，CIK细胞：使用50ml医用注射器将每个培养瓶中细胞悬液等量均分转入2个细胞培养袋，加入无血清细胞培养液(≥400ml/袋)和细胞因子激活液IL-2，使细胞终浓度约为1×10⁵cells/ml，IL-2终浓度为500IU/ml，置饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养。DC细胞：培养至第四天，向DC细胞培养瓶中加入10ul DC细胞诱导因子IL-4和GM-CSF(100-800U/ml)混合液；

培养至第6天，CIK细胞：每袋添加细胞因子激活液IL-2，使其终浓度为500IU/ml。DC细胞：加入肿瘤抗原5ul；

培养至第7天，DC细胞：加入DC细胞诱导因子TNF-α(100-800U/ml)，10ul；

培养至第8天，将1/2的DC细胞冻存为2份，分别标示为DC疫苗1、DC疫苗2，剩余DC细胞与CIK细胞共培养并向其中添加1.5倍的无血清细胞培养液和相应的细胞因子激活液IL-2(终浓度为50IU/ml)，并计数。抽取5ml/袋，详细填写好验单项目后，送检验科做真菌、细菌检测；

第10天，每袋细胞添加0.5倍的无血清细胞培养液和相应的细胞因子激活液IL-2(终浓度为50IU/ml)，计数并取样做细菌、真菌、内毒素、支原体检测，确认检测结果合格后，回输DC-CIK；

第12天，每袋细胞添加0.5倍的无血清细胞培养液和相应的细胞因子激活液IL-2(终浓度为50IU/ml)，计数并取样做细菌、真菌、内毒素、支原体检测，确认检测结果合格后，回输DC-CIK；

第14天，详细观察细胞生长状态后，随机均匀抽样5ml，台盼蓝染色法计数活细胞、死细胞总数量，同时取样做淋巴细胞表面标记检测；并确认细胞悬液细菌、真菌涂片、支原体及内毒素检测为阴性后，回输DC-CIK及DC疫苗2。收集细胞约4000ml，离心(1500rpm，8min)，洗液(含有0.2％人白蛋白的注射用生理盐水)洗涤(1500rpm，8min)2次，洗液按照500ml生理盐水、50万IU的IL-2、5ml 20％人血清白蛋白的配比，重悬细胞，将其装入细胞回输袋用热合机将管口热合封闭，并留样封存。