[发明专利]一种用质谱法检测人体中多种痕量激素的方法

权利要求书

1.一种用质谱法检测人体中多种痕量激素的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

(1)配制试剂：准备甲醇(色谱级)，甲酸铵(色谱级)；

0.2mol/L甲酸铵溶液：1.26g甲酸铵用水溶解并定容到100mL；

2mmol/L甲酸铵溶液：吸取1mL 0.2mol/L甲酸铵溶液，加入到水中溶解并定容至100mL；

2mmol/L的甲酸铵甲醇溶液：吸取1mL 0.2mol/L甲酸铵溶液加入到甲醇中溶解并定容至100mL；

(2)配制萃取溶剂：准备甲基叔丁基醚(色谱级)，正己烷(色谱级)，乙酸乙酯(色谱级)，按照正己烷：乙酸乙酯：甲基叔丁基醚＝1:1:1(体积比)配制萃取溶剂；

(3)配制标准储备液：准备11种标准物质，睾酮、雄烯二酮、二氢睾酮、孕酮、17-羟孕酮、皮质醇、皮质酮、皮质脂酮、醛固酮、脱氢表雄酮和孕烯醇酮，纯度均97％，分别准确称取10mg以上标准物质，用甲醇配制成一定浓度标准储备液，-18℃冷冻避光保存；

(4)配制内标物质储备液：准备同位素内标物质，睾酮-d5，孕酮-d9,17-羟孕酮-d8，醛固酮-d7，皮质醇-d4，脱氢表雄酮-d6，皮质酮-d8，皮质脂酮-d8，根据同位素内标物质的容量，用甲醇配制成0.1-1.0mg/mL的内标储备液，-18℃冷冻避光保存；

(5)配制标准曲线溶液：

使用标准储备液、内标物质储备液，配制孕酮、17-羟孕酮、雄烯二酮、皮质酮的线性浓度点为0.05、0.2、0.5、2.0、5.0、10、20mg/L，内标为1.0mg/L，配制睾酮、二氢睾酮、皮质脂酮、醛固酮的线性浓度点为0.1、0.2、0.5、2.0、5.0、10、20mg/L，内标为1.0mg/L，配制皮质醇的线性浓度点为1.0、5.0、10、20、50、100、200mg/L，内标为1.0mg/L，配制脱氢表雄酮、孕烯醇酮的线性浓度点为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50mg/L，内标为10mg/L；具体地，吸取适当体积和浓度的标准储备液，每个浓度点加适当体积0.1mg/L的内标物质储备液，用2mmol/L的甲酸铵水溶液：2mmol/L的甲酸铵甲醇＝2:8(体积比)溶液定容到1mL；

(6)样品处理：

准确移取血清样本400μL，测定睾酮、雄烯二酮、二氢睾酮、孕酮、17-羟孕酮、皮质醇、皮质酮、皮质脂酮、醛固酮9种类固醇激素时，加入0.01mg/L的内标20μL，测定脱氢表雄酮和孕烯醇酮2种类固醇激素时，加入0.1mg/L的内标20μL；涡旋30s，加入萃取溶剂1.0mL，涡旋3min，4000r/min离心5min，取上0.9mL清液至另一个离心管中，再加0.8mL萃取溶液，重复一次，合并两次萃取液，氮吹干，用2mmol/L的甲酸铵水溶液：2mmol/L的甲酸铵甲醇＝2:8(体积比)溶液定容到0.2mL，上机待测；

(7)质谱仪检测样品：

色谱条件：

a.色谱柱：CORTECS-C18,2.7μm,100mm×2.1mm；

b.流动相：流动相A：2mmol/L甲酸铵水溶液；流动相B:2mmol/L甲酸铵甲醇溶液；

c.流速：0.4mL/min；

d.柱温：40℃；

e.进样量：20uL；

质谱条件：

a.离子源：电喷雾离子源；

b.扫描方式：正离子扫描；

c.检测方式：多反应监测；

d.IonSpray Voltage：5500V；

e.Temperature：600℃；

f.Curtain Gas：25μL/min；

g.Collision Gas：7μL/min；

h.Ion Source Gas 1：50μL/min；

i.Ion Source Gas 2：55μL/min；

j.定性离子对、定量离子对、碰撞能量及去簇电压；

通过以上条件设置的质谱仪，对11种类固醇激素溶液的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压进行测定；

(8)液相色谱/串联质谱测定结果：

a.定性测定

按照上述步骤测定样品溶液和标准溶液，如果样品溶液的质量色谱峰保留时间和标准溶液一致；定性离子对的相对丰度与相当浓度的混合溶液的相对丰度相一致，相对丰度偏差不超过定性测定时离子相对丰度的最大允许偏差，则可判断样品中存在相应的被测物；

b.定量测定

待仪器稳定后，将样品溶液与标准溶液等体积进样，绘制标准工作曲线，采用内标法对样品进行定量计算，样液中待分析物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，得到定量结果。