[发明专利]褐牙鲆卵壳前体蛋白夹心ELISA试剂盒及其检测方法与应用

说明书

褐牙鲆卵壳前体蛋白夹心ELISA试剂盒及其检测方法与应用。通过原核表达的方法制备褐牙鲆卵壳前体蛋白，免疫小鼠开发褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体，并将辣根过氧化物酶标记到纯化的抗体上；将褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品、鼠抗褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的鼠抗褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体、空白96孔酶标板、以及包被液、洗涤液、封闭液、样品稀释液、显色液、终止液各1支共同装入盒体，得到检测褐牙鲆卵壳前体蛋白的夹心ELISA试剂盒。本发明的试剂盒能够灵敏、准确定量褐牙鲆血浆、整体匀浆液、肝脏组织及肝细胞培养液中的卵壳前体蛋白，检测范围为1.95～250 ng/mL^‑1，为海洋环境雌激素的筛选、检测和生态环境风险评价提供重要工具。

技术领域

本发明属于环境检测领域，具体涉及一种褐牙鲆卵壳前体蛋白夹心ELISA试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

环境雌激素作为一类外源性化合物进入机体后，具有干扰体内正常分泌物质的合成、释放、运转、代谢、结合等过程，激活或抑制内分泌系统功能，从而破坏其维持机体稳定性和调控作用。近年来，环境中雌激素污染对自然环境的生态平衡及人类的健康构成了潜在的威胁,环境雌激素物质进入人体后，女性多出现子宫肌瘤、卵巢癌等疾病，男性多出现睾丸癌、精子的数量与质量下降等症状。低于1 ng/L的雌炔醇能导致雄性魟鳟产生雌鱼特有的卵黄原蛋白，而4 ng/L的雌炔醇可导致幼鱼的性畸形，其第二性征发生改变。海洋环境雌激素可导致鱼类种群生存力和渔业资源下降。海洋环境雌激素污染日益严重，其中我国近岸海水中雌二醇、雌炔醇、双酚A等常见雌激素的浓度达到45.7 ng/L、3.99 ng/L、3920ng/L。因此，为解决我国近海海域环境雌激素活性的检测，亟需建立更灵敏、准确、简便的检测技术。

卵壳前体蛋白是近年来新发现的一种环境雌激素生物标志物，是一种雌性特异性蛋白，通常在雄鱼和幼鱼体内并不存在，但是在环境雌激素的诱导下能合成和分泌卵壳前体蛋白。通过检测雄鱼或幼鱼体内的卵壳前体蛋白含量可以评价水体环境中的雌激素活性。与目前常用的环境雌激素生物标志物卵黄原蛋白相比，卵壳前体蛋白能更加敏感快速地对环境雌激素做出响应。1 ng/L E₂就能显著上调雄性海洋青鳉(Oryzias javanicus)的肝脏卵壳前体蛋白基因表达水平，并且其相对表达量要明显高于卵黄原蛋白的基因表达水平。因此，卵壳前体蛋白是环境雌激素筛选的更加敏感的生物标志物，然而目前国内外均未建立卵壳前体蛋白的检测试剂盒，主要原因在于传统的分离纯化方法难以从鱼体获得卵壳前体蛋白，无法为ELISA的开发提供高纯度的抗原，导致至今仍无法建立准确定量卵壳前体蛋白的ELISA方法。因此，本发明采用原核表达技术制备重组卵壳前体蛋白，制备高灵敏度的抗体，从而建立卵壳前体蛋白的免疫检测技术，制备能够检测海洋雌激素活性的试剂盒。

褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)属于鲽形目，鲆科，牙鲆亚科，牙鲆属，是我国重要的海水养殖经济鱼类。褐牙鲆通常只在近海活动，不会进行长距离洄游，能准确地反映栖息地的污染状况，非常适合用作海洋污染物监测的指示鱼种。主要分布于中国的黄渤海、东海以及朝鲜、日本沿岸水域。因此，为实现我国近海海域环境雌激素活性的检测，本发明利用褐牙鲆的卵壳前体蛋白作为生物标志物对环境雌激素进行检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种褐牙鲆卵壳前体蛋白夹心ELISA试剂盒及其检测方法与应用，以满足现有技术的上述要求。

一种检测褐牙鲆卵壳前体蛋白夹心ELISA试剂盒，包括空白96孔酶标板1块，包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止剂，

其特征在于还包括褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品1支、鼠抗褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体1支、辣根过氧化物酶标记的鼠抗褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体1支。

上述检测褐牙鲆卵壳前体蛋白的夹心ELISA试剂盒中，

所述的褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品，是利用原核表达技术制备的；