[发明专利]褐牙鲆卵壳前体蛋白夹心ELISA试剂盒及其检测方法与应用

权利要求书

1.一种检测褐牙鲆卵壳前体蛋白的夹心ELISA试剂盒，包括空白96孔酶标板1块，包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液各1支，

其特征在于还包括褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品1支、鼠抗褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体1支、辣根过氧化物酶标记的鼠抗褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体1支；

所述的褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品是用以下方法制备：

(1) 通过肌肉注射17β-雌二醇诱导褐牙鲆肝脏大量转录Chg H mRNA，用Trizol提取肝脏总RNA，经反转录获得cDNA，以反转后的cDNA为模版，利用引物F:CACCCAAGTTTTCAAGTCTCAGCAGTC，R:CCGCTTACTGAGCAGGGTCAATGAAT进行PCR扩增，回收目的片段；用T4连接酶将目的片段与pClone007载体连接后，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，并进行测序，将测序正确的进行扩大培养，抽提质粒，以上述引物进行PCR扩增，切胶回收目的片段；

(2) 将回收的目的片段与pDE1表达载体连接后，将连接产物转化至表达宿主菌BL21(DE3)；并将正确表达的宿主菌扩大培养，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，置于37℃恒温摇床里震荡培养10小时，将培养好的菌液5000 rpm 离心20 min，收集沉淀，经裂解液处理后，再次离心收集包涵体，向包涵体中加入30 mL溶解液，所述溶解液是100 mM Tris，500 mMNaCl，10 mM咪唑，8 M尿素，pH8.0；4℃搅拌过夜；将溶解后的包涵体10000 rpm 离心30min，收集上清并过0.45 μm滤膜，采用镍离子螯合磁珠纯化，即获得褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品；

所述的鼠抗褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体是用以下方法制备：

将0.1 mL含有70 µg的上述步骤得到的褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品和等体积的弗式完全佐剂乳化后注射入小鼠腹腔，两周后用同样剂量的褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品与弗氏不完全佐剂充分乳化后对Balb/c小鼠进行加强免疫，一周后尾静脉注射褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品进行加强免疫，三天后取小鼠的血清，利用Protein G亲和层析柱从血清中纯化获得免疫球蛋白IgG，纯化的免疫球蛋白IgG经PBS缓冲液透析24 h，即获得鼠抗褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体；

所述的辣根过氧化物酶标记鼠抗褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体是用以下方法制备：

将1 mg辣根过氧化物酶加入到2 ml新配的0.1 M NaIO₄溶液，避光搅拌20 min；将溶液装入透析袋中，用1 mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析过夜；加入0.16 M乙二醇水溶液0.5 ml，室温放置30 min；加入1 mg上述步骤得到的褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体，随后用0.05M pH9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，使鼠抗褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体与辣根过氧化物酶充分结合；加入5mg/ml的NaBH₄溶液0.1ml，混匀，装入透析袋，4℃下PBS透析过夜；3000r/min离心30 min，收集上清液即为辣根过氧化物酶标记鼠抗褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体。

2.权利要求1所述的褐牙鲆卵壳前体蛋白夹心ELISA试剂盒在海洋环境雌激素污染检测中的应用。

3.利用权利要求1所述的褐牙鲆卵壳前体蛋白夹心ELISA试剂盒检测内分泌扰乱化学物质的方法，其特征在于包括以下步骤：

1) 用包被液稀释试剂盒中的褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体至5μg/ml，在空白96孔酶标板中加入100 μL/孔，4℃包被过夜，弃去孔内溶液，洗涤3次；

2) 在96孔酶标板中加入封闭液，300 μL/孔，室温下孵育1小时，弃去孔内溶液，洗涤3次；

3) 用样品稀释液将褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品稀释至3.9、7.8、15.62、31.25、62.5、125、250 ng/mL作为标准物；在96孔酶标板中加入各纯品、待测样品100 μL/孔，37℃下孵育1小时，弃去孔内溶液，洗涤5次；

4) 在96孔酶标板中加入用样品稀释液1:4000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体，100 μL/孔，室温孵育1小时，弃去孔内溶液，洗涤5次；

5) 在96孔酶标板中加入显色液，100 μL/孔，于室温暗处37℃反应10min；

6) 待呈现明显的黄色后加终止液，50 μL/孔；

7) 用酶标仪测定450 nm波长下各孔的吸光值，测定在加终止液后15分钟以内进行；

8) 计算：以标准物的浓度的对数值为横坐标，OD值为纵坐标作标准曲线，用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品中褐牙鲆卵壳前体蛋白的实际浓度。