[发明专利]一种同时检测多种氨基糖苷类抗生素的方法

说明书

本发明属于小分子物质检测领域，具体涉及一种同时检测多种氨基糖苷类抗生素的方法。本发明利用硝酸纤维素膜固化氨基糖苷类抗生素包被原，酶标记氨基糖苷类抗生素，通过抗原‑抗体特异性结合固化在膜上，因辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶与底物发生反应产生具有一定颜色的产物，且该产物能够长时间稳定存在这一特性，故可以在5~20分钟内直接肉眼判读检测结果；实现了对待测样本中多种氨基糖苷类抗生素的快速同时检测；相比于传统免疫分析方法，具有检测高效、成本低廉、耗时短等优点。同时，检测结果肉眼可判读，具有便捷性和实用性，其应用范围更为广泛，尤其适用于液体样本中的氨基糖苷类抗生素快速筛查。

技术领域

本发明属于小分子物质检测领域，具体涉及一种同时检测多种氨基糖苷类抗生素的方法。

背景技术

氨基糖苷类抗生素（Aminoglycosides，AGs），通过与细菌的沉降系数为 70s核糖体的 30s 亚基部位结合，抑制始动复合物形成，阻碍终止因子的作用，阻碍合成的蛋白的释放，从而抑制细菌体内的蛋白质合成，从而抑制细菌生长。在动物医学领域，AGs主要用于防治牛乳腺炎、肠炎、子宫炎、腹膜炎败血症等，同时还可以促进动物的生长。然而AGs具有较明显的肾毒性、耳毒性以及前庭神经功能损害，严重时还会致人休克，甚至死亡。我国、欧盟、日本以及美国均制定了AGs的最高残留限量（Maximum Residue Limit，MRL），目前主要针对庆大霉素、卡那霉素、新霉素以及链霉素/双氢链霉素设有MRLs，其中在牛奶中卡那霉素的MRL分别为100ng/mL、150ng/mL、1500ng/mL和200ng/mL。常用的AGs的检测方法主要为仪器分析方法，包括HPLC、LC-MS等方法，具有准确性好、灵敏度高的优点，但是由于所用仪器昂贵，而且存在测试成本高、分析时间长、检测所需样品量大及前处理步骤繁琐等不足，无法实现大量样本的快速、灵敏检测。

基于抗原抗体特异性反应的免疫分析方法，具有灵敏度高、方便快捷、高通量、低成本等优势，已广泛应用于食品与环境中小分子物质的分析检测。但是，目前免疫分析方法多用于单一物质检测，而能够在一次检测中实现多种残留物质的同时检测，一直是分析检测领域研究的重要方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时检测多种氨基糖苷类抗生素残留物质的方法，可以同时快速检测液体待测样本中是否含有氨基糖苷类抗生素。

为实现上述目的，本发明提供了一种同时检测多种氨基糖苷类抗生素的检测方法，根据本发明的实施例，所述方法包括：

（1）制备氨基糖苷类抗生素包被原；

（2）分别将氨基糖苷类抗生素包被原和抗小鼠二抗点样于在硝酸纤维素膜的不同点样区域内；氨基糖苷类抗生素包被原点样区域为检测区域，抗小鼠二抗点样区域为阳性对照区，过夜包被后，用脱脂奶粉封闭；

（3）将与氨基糖苷类抗生素包被原对应的酶标记氨基糖苷类抗生素单克隆抗体和待测样品混匀后滴加在包被好的硝酸纤维素膜上，使酶标记的抗体与包被原特异性结合；

（4）特异性结合反应结束后加入PBST缓冲液洗涤，加入显色液，根据显色情况判断检测结果；

（5）结果判定：检测区的深浅与相应的氨基糖苷类抗生素含量成反比，即抗生素含量越高，显色越浅，抗生素含量越低，显色越深；若对照区域没有显色出现，则检测结果无效。

根据本发明，步骤（1）中所述氨基糖苷类抗生素包被原为庆大霉素包被原、卡那霉素包被原、链霉素包被原、新霉素包被原中的一种或多种。

步骤（2）中所述检测区域为一个或多个。

根据本发明，步骤（3）中所述酶标记氨基糖苷类抗生素单克隆抗体中的酶为辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶。