[发明专利]一种CAR-T细胞的制备方法在审
| 申请号： | 201910054298.7 | 申请日： | 2019-01-21 |
| 公开（公告）号： | CN109762788A | 公开（公告）日： | 2019-05-17 |
| 发明（设计）人： | 张青;郑骏年;丁佳戈 | 申请（专利权）人： | 徐州医科大学 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/867 |
| 代理公司： | 北京品源专利代理有限公司 11332 | 代理人： | 巩克栋 |
| 地址： | 221002 江苏省徐*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 阳性率 制备 延缓 体内 分化 慢病毒感染 细胞 存活状态 杀伤能力 体外检测 治疗效果 记忆性 存活 受损 应用 | ||
1.一种CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)分离外周血单个核细胞，得到T淋巴细胞；
(2)将步骤(1)的T淋巴细胞激活的同时加入Akt抑制剂孵育培养；
(3)将包含嵌合抗原受体的慢病毒载体或慢病毒在Akt抑制剂的作用下转导或感染步骤(2)孵育培养的T淋巴细胞，得到CAR-T细胞并进行增殖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述分离的方法包括Ficoll密度梯度离心法和/或percoll分层液法，优选为Ficoll密度梯度离心法。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述Akt抑制剂包括A6730、B2311、124018、RX-0201、VQD-002、LY294002、Akti-1、Akti-2、Akt抑制剂III、Akt抑制剂VIII或MK-2206中的任意一种或至少两种的组合，优选为MK2206。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述Akt抑制剂的浓度为0.1-2μM。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述激活的方法为加入抗体磁珠活化刺激。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗体包括CD3和/或CD28。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述Akt抑制剂包括6730、B2311、124018、RX-0201、VQD-002、LY294002、Akti-1、Akti-2、Akt抑制剂III、Akt抑制剂VIII或MK-2206中的任意一种或至少两种的组合，优选为MK2206。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述Akt抑制剂的浓度为0.1-2μM；
优选地，步骤(3)所述转导的时间为激活后24-48h。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，得到T淋巴细胞；
(2)将步骤(1)的T淋巴细胞与CD3、CD28抗体偶联的磁珠相接触激活的同时加入0.1-2μM的Akt抑制剂MK2206孵育培养；
(3)将包含嵌合抗原受体的慢病毒载体或慢病毒在0.1-2μM的Akt抑制剂MK2206的作用下转导或感染步骤(2)孵育培养24-48h的T淋巴细胞，得到CAR-T细胞并进行增殖。
10.一种采用权利要求1-9中任一项所述方法制备得到的CAR-T细胞。
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