[发明专利]一种mRNA甲基转移酶缺陷型腮腺炎病毒及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种mRNA甲基转移酶缺陷型腮腺炎病毒及其制备方法和应用，属于反向遗传学技术领域。所述mRNA甲基转移酶缺陷型腮腺炎病毒，由腮腺炎病毒疫苗S79株进行定点突变制得，其中L蛋白第1792位的氨基酸由K突变为A，或第1814位的氨基酸由A突变为G，或第1816位的氨基酸由G突变为A，或第1818位的氨基酸由G突变为A，或第1892位的氨基酸由D突变为A，或第1917位的氨基酸由D突变为A，或第1953位的氨基酸由K突变为A，或第1990位的E突变为A。本发明通过定点突变，拯救出的重组腮腺炎病毒病毒毒力减弱，免疫原性良好，既保留了腮腺炎病毒减毒疫苗的免疫原性，又提高了其安全性。

技术领域

本发明涉及反向遗传学技术领域，具体涉及一种mRNA甲基转移酶缺陷型腮腺炎病毒及其制备方法和应用。

背景技术

疫苗是指用各类病原微生物制作的用于预防接种的生物制品。接种疫苗是预防和控制传染病最经济、有效的公共卫生干预措施，对于家庭来说也是减少成员疾病发生、减少医疗费用的有效手段。

疫苗的开发是一个漫长而复杂的过程，且成本很高。全病毒灭活疫苗、裂解腮腺炎疫苗和亚单位疫苗免疫保护效果远不及减毒疫苗，而利用传统方法制备的腮腺炎减毒疫苗存在着耗时、耗力和毒力恢复等缺陷。随着反向遗传学技术的迅速发展，为高效开发安全性高的腮腺炎病毒疫苗提供了可能。反向遗传学技术(reverse genetics)是近几年快速发展的一项新的生物技术，应用于病毒的反向遗传学技术又叫“病毒拯救(virus rescue)。病毒拯救技术是在了解病毒复制特点等基础上利用分子生物学技术而建立和完善起来的，通过人工操作病毒基因，将适当形式的病毒核酸，在一定条件下转染细胞产生有感染性的病毒颗粒。病毒拯救技术尤其是完全以质粒为基础的操作技术实现了在cDNA水平上对RNA病毒的操作，方便人工改造病毒，这是20世纪90年代RNA病毒研究中的重大突破，成为生命科学研究热点。反向遗传学技术在对病毒的生活周期、基因结构与功能、致病基础、新型疫苗构建、表达外源蛋白等方面的研究中显示了良好的应用前景。

腮腺炎是一种由腮腺炎病毒引起的急性病毒性呼吸道传染病，能引起多种并发症。发达国家自广泛应用腮腺炎疫苗后，发病率下降88％～99％。但应用含Urabe或LZagreb疫苗株的腮腺炎疫苗或麻疹-腮腺炎-风疹(MMR)联合疫苗后，发生不良反应如无菌性脑膜炎者较多。国内广泛使用的腮腺炎疫苗株为S79株，较为安全，其抗体阳转率≥85％，免疫保护率为78～87％。

腮腺炎病毒(MuV)，是副粘病毒科，腮腺炎病毒属的单股负链RNA病毒，减毒活疫苗株S79的核酸长度为15384bp，核酸序列为3-NP-P-M-F-SH-HN-L-5。腮腺炎病毒的基因组是负义RNA，病毒核酸不具有感染性，各个RNA片段必须与聚合酶蛋白及核蛋白结合在一起形成核糖核蛋白复合物即RNPs才有活性。

腮腺炎病毒感染宿主时，首先与宿主细胞表面的特异性受体结合，通过与胞膜融合进入细胞后释放出RNPs，RNPs进入细胞后才开始病毒基因组的复制和转录，每个RNA片段单独组成一个转录单位，转录出mRNA和互补RNA(cRNA)，mRNA翻译合成病毒蛋白，cRNA复制生成病毒负链子代RNA，进而在细胞浆中组装成完整的病毒粒子。

近几年我国腮腺炎发病率出现明显的上升趋势。主要发病人群为15岁以下儿童；大多数省份发病曲线有两个高峰。未接种疫苗、疫苗接种剂次不足及病毒变异，免疫效力减弱是腮腺炎发病率居高不下的主要原因。这都提示开发新的免疫原性更高，毒副作用更小的腮腺炎疫苗株的必要性。

发明内容

本发明的目的在于利用反向遗传学和基因定点突变的方法制备一种mRNA甲基转移酶缺陷型腮腺炎病毒疫苗，既保留了腮腺炎病毒减毒疫苗的免疫原性，又提高了其安全性；同时提供一种可以应用于该种疫苗生产的拯救系统，使得制备的疫苗具有很好的时效性，以克服现有腮腺炎病毒疫苗生产中的不足。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：