[发明专利]指导核酸的产生和用途

权利要求书

1.一种制备核酸的集合的方法，其包括：

a.获得靶核酸，每个靶核酸包含核酸指导的核酸酶的PAM位点；

b.使第一引物与所述靶核酸的PAM位点杂交，其中所述第一引物包含(i)与所述PAM位点互补的MAP位点，(ii)与所述核酸指导的核酸酶的识别位点互补的互补识别位点，和(iii)与启动子位点互补的互补启动子位点；

c.使用所述靶核酸作为模板延伸所述第一引物，由此产生包含所述第一引物的序列和与所述靶核酸互补的序列的第一延伸产物；

d.使第二引物与所述第一延伸产物杂交；和

e.使用所述第一延伸产物作为模板延伸所述第二引物，由此产生包含所述PAM位点、所述识别位点和所述启动子位点的第二延伸产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二引物包含(i)所述核酸指导的核酸酶的PAM位点和(ii)随机序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述随机序列的长度介于约6个与约8个碱基之间。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一引物进一步包含限制酶的限制酶位点。

5.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：

f.使衔接子与所述第二延伸产物连接，其中所述衔接子包含限制酶的限制酶位点；和

g.用所述限制酶切割所述第二延伸产物，使得从所述识别位点切割所述PAM位点和所述限制位点。

6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述限制酶包含MmeI、FokI或MlyI。

7.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括去除未结合的第一引物或未结合的第二引物。

8.根据权利要求1所述的方法，其中延伸所述第一引物或延伸所述第二引物是用标记的核苷酸进行的。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述标记的核苷酸包含生物素化的核苷酸。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述识别位点的长度为约20个核苷酸。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述识别位点的长度为约15至约25个核苷酸。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸指导的核酸酶包含Cas系统蛋白。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸指导的核酸酶包含Cas9系统蛋白。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包含基因组DNA或cDNA。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包含人DNA。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包含宿主DNA。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包含真核生物DNA。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述互补识别位点包含至少一个修饰的核酸键。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述修饰的核酸键选自锁核酸(LNA)、桥连核酸(BNA)、肽核酸(PNA)、拉链核酸(ZNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)和硫代磷酸(PTO)。

20.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使用所述启动子位点转录所述第二延伸产物。