[发明专利]生物样品中原位抗原修复的方法及其成像

说明书

本发明涉及用于样品的原位温度诱导的抗原修复的装置和方法，其中所有步骤均在高于大气压的压力下对固定在样品支撑件上的样品进行，其可以在相同的样品支撑件上进一步进行染色和成像，可选地通过循环多路复用，该循环多路复用通过以快速、高度灵敏和可靠的方式在同一样品上进行多分子读数，使各种分子靶标成像。

发明领域

本发明总体上涉及生物样品制备领域，特别是基于样品的原位成像的抗原修复(antigen retrieval)。

发明背景

免疫组织化学(IHC)是一种涉及使用特定探针分子(例如抗体)来检测组织样品中细胞可能表达的特定生物标志物(例如抗原)是否存在的技术。IHC被广泛用于临床和研究领域，例如用于诊断特定疾病(例如某种癌症)或用于研究疾病预后与新型生物标志物表达之间的相关性。IHC的主要应用领域是癌症诊断；但它还具有其它应用领域，包括检测诸如病毒等的传染源(McMahon等，1996；Histochem J，28(3)：157-64)，并有助于诊断其它疾病，例如老年痴呆症(Dandrea等，2001，生物技术组织化学(Biotech Histochem)，76(2)：97-106)。

抗原修复(AR)是IHC的一种预处理技术，用于提高各种类型的组织样品(主要是福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)组织切片)的抗原性。自最初引入以来，它已迅速被用作各种组织类型和靶标标志物的行业金标准(Shi等，1991，组织化学与细胞化学杂志(JHistochem Cytochem)，39：741-748；US 5,244,787)。

尽管尚不清楚抗原修复过程效果背后的确切机制，但其逆转福尔马林诱导的肽键形成以激活靶表位的作用已成共识。有两种主要方法可用于提高表位的反应性：酶诱导的抗原修复(EIAR)和热诱导的抗原修复(HIAR)。由于酶物质的固有催化特性，EIAR具有更高的潜力干扰组织形态并使靶蛋白位点失去功能(Werner等，1996，组织化学和细胞生物学(Histochemistry and Cell Biology)，105：4253-260)。因此，HIAR是两者中使用更广泛的方法。

有不同的装置和方法来执行HIAR。常规方法是在含有碱性缓冲液的热浴中孵育样品。对于这种方法，作为普遍趋势，在较低的AR温度下，需要更长的培养时间，才能获得相同的抗原性。例如，据报道在60℃过夜培养或在95℃培养1小时均成功用于预-IHC AR(Yamashita，2007，细胞组织化学(Prog Histochem Cytochem)，41(3)：141-2007)。微波处理是另一种常用的方法，其中样品经过恒定功率微波处理或加热-暂停循环(US 5,244,787)。它还用于改善免疫荧光的抗原性(Long和C.Buggs，2008年，分子组织学杂志(J MolHistol).39(1):1-4)和特殊的染色应用(Temel等，2005，生物技术组织化学(BiotechHistochem).80(3-4):123-32)。

也可以结合使用HIAR和EIAR方法。Key等人，公开了含有热稳定酶的AR缓冲液，可用于FFPE样品的微波处理。用这些方法显示了成功的各种乳腺癌标志物的AR，其中AR温度高达100℃(WO 2009/110936)。另一种替代方法为压力辅助的HIAR，其可以将AR介质的温度提高到高于其大气沸腾温度。为此，Angros等人公开了一种在高压环境中执行AR的自动化装置(US7,951,612)。

HIAR可以在不同的环境中执行，也可以在为不同溶液中执行，以提高AR的性能。例如，Gourevitch公开了在AR期间促进样品完整性的新的解决方案(US 2004/0029184)，并且Namimatsu公开了使用含有CCA和NaOH的AR溶液来增强AR性能(US 2002/0182653)。Eriksen公开了掺有各种非离子表面活性剂的AR溶液，以逆转存在于目标表位中的胺基之间的特定交联(US 9,506,928)。