[发明专利]经由核递送CRISPR/CAS9导向编辑细胞RNA

说明书

本文公开了使用RNA‑靶向CRISPR/Cas9以单核苷酸分辨率进行可编程RNA编辑的技术。申请人将该方法称之为“Cas9导向RNA编辑”或“CREDIT”，该方法提供以时间方式可逆地改变遗传信息的方式，不同于依赖于永久改变DNA序列的传统CRISPR/Cas9驱动的基因组工程改造。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年5月10日提交的美国临时申请号62/504,497的优先权，其内容通过引用其全文纳入本文。

政府支持声明

本发明是在政府支持下由国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号HG004659和NS075449资助完成。政府对本发明拥有一定的权利。

背景

旨在靶向并操作活细胞中RNA的本策略主要依赖于使用反义寡核苷酸(ASO)或工程改造的RNA结合蛋白(RBP)。虽然ASO疗法已经在消除致病转录本或操纵RBP结合中显示出巨大前景，但是它们是合成构建的，并因此不能在DNA内被编码。这使得潜在的基因疗法策略复杂化，该策略将依赖于在患者的一生中定期给予ASO。此外，它们不能够调节RNA的遗传序列。虽然可以设计RBP，诸如蛋白质的Pumilio和FBF同源家族(RUF)，以识别靶转录本并与RNA修饰效应物融合，从而能够特异性的识别和操纵，基于这类类型构建体的平台需要针对各种靶标进行大量的蛋白质工程改造并且可以证明是困难且昂贵的。

当前用于直接编辑RNA的系统基于不可编码组件，如化学融合向导RNA与编辑酶部分(例如，SNAP标签)，或者相对低亲和力栓系，其通过融合可编辑适配体结合部分(例如，BoxB蛋白)。

当前的CRISPR/Cas RNA靶向系统通常使用单向导RNA以及任选地，交替的2’OMeRNA(alternating 2’OMe RNA)和DNA碱基(PAM聚体(PAMmer))的寡核苷酸，以提供用于靶向活细胞中特异性RNA分子的简单且快速的可编程系统。然而，对于这些系统的改进和/或替代方案可以协助解决与效率、特异性和/或脱靶编辑事件相关的问题。本发明解决了这些需求并提供了相关的优点。

发明内容

因此，本文提供了可编辑且高度特异性的CRISPR/Cas系统、组合物和方法以实现以简单、可靠和多功能的方式高效且可逆地操纵和调节靶DNA。

在一些方面中，本文提供了用于对靶RNA进行CRISPR/Cas导向RNA编辑(CRISPR/Cas-directed RNA edit)的重组表达系统，其包括，或由下述组成或基本上由下述组成：(A)编码CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白的核酸序列，所述CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白包含与RNA依赖性腺苷脱氨酶(Adenosine Deaminase acting on RNA，ADAR)催化活性脱氨酶结构域融合的核酸酶失活(nuclease-dead)CRISPR相关内切核酸酶(dCas)；和(B)编码延长单向导RNA(esgRNA)的核酸序列，所述esgRNA包含：(i)与靶RNA具有同源性的短延伸序列，其包含针对靶腺苷的错配，和(ii)dCas支架结合序列。在一些实施方式中，所述表达系统表达dCas-ADAR核蛋白复合物，其能够对靶序列进行CRISPR/Cas RNA-RNA碱基特异性腺苷至肌苷(A-I)编辑。

在重组表达系统的一些实施方式中，esgRNA进一步包含(iii)间隔子序列，所述间隔子序列含有与靶RNA具有同源性的区域。

在重组表达系统的一些实施方式中，(A)和(B)包含在同一载体内或者包含在不同的载体内。在重组表达系统的一些实施方式中，载体是病毒载体。在重组表达系统的一些实施方式中，病毒载体是腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体或腺病毒载体。