[发明专利]经由核递送CRISPR/CAS9导向编辑细胞RNA在审
| 申请号： | 201880046061.8 | 申请日： | 2018-05-09 |
| 公开（公告）号： | CN110869498A | 公开（公告）日： | 2020-03-06 |
| 发明（设计）人： | E·叶;K·布莱南;R·玛丽娜;D·尼尔斯 | 申请（专利权）人： | 加利福尼亚大学董事会 |
| 主分类号： | C12N9/22 | 分类号： | C12N9/22;C12N9/78;C12N15/113;C12P19/34 |
| 代理公司： | 上海专利商标事务所有限公司 31100 | 代理人： | 余颖;钱文宇 |
| 地址： | 美国加利*** | 国省代码： | 暂无信息 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 经由 递送 crispr cas9 导向 编辑 细胞 rna | ||
1.一种用于对靶RNA进行CRISPR/Cas导向RNA编辑的重组表达系统，其包含：
(A)编码CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白的核酸序列，所述CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白包含与RNA依赖性腺苷脱氨酶(ADAR)的催化活性脱氨酶结构域融合的核酸酶失活CRISPR相关内切核酸酶(dCas)；和
(B)编码延长单向导RNA(esgRNA)的核酸序列，所述esgRNA包含：(i)与所述靶RNA具有同源性的短延伸序列，其包含针对靶腺苷的错配，和(ii)dCas支架结合序列。
2.如权利要求1所述的重组表达系统，其中，所述esgRNA进一步包含(iii)间隔子序列，所述间隔子序列含有与所述靶RNA具有同源性的区域。
3.如权利要求1所述的重组表达系统，其中，(A)和(B)包含在同一载体内或者包含在不同的载体内。
4.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其中，所述ADAR选自下组：ADAR1、ADAR2和ADAR3。
5.如权利要求4所述的重组表达系统，其中，所述ADAR的催化活性脱氨酶结构域是ADAR2的催化活性脱氨酶结构域。
6.如权利要求5所述的重组表达系统，其中，所述ADAR2的催化活性脱氨酶结构域是(1)人ADAR2的野生型催化活性脱氨酶结构域或(2)相较于所述野生型人ADAR2催化活性增强的ADAR2的突变型人催化活性脱氨酶结构域。
7.如权利要求6所述的重组表达系统，其中，ADAR2的突变型人催化活性脱氨酶结构域包含E488Q突变。
8.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其中，所述dCas是核酸酶失活Cas9(dCas9)。
9.如权利要求8所述的重组表达系统，其中，所述dCas9 N末端结构域与所述ADAR的催化活性脱氨酶结构域的C末端融合。
10.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其中，所述dCas与所述ADAR的催化活性脱氨酶结构域经由接头融合。
11.如权利要求10所述的重组表达系统，其中，所述接头是半柔性XTEN肽接头。
12.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其中，所述esgRNA的短延伸序列是3'延伸序列。
13.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其中，所述esgRNA的短延伸序列包含能够与靶序列接近完美RNA-RNA碱基配对的同源性区域。
14.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其中，所述esgRNA的短延伸序列还包含针对所述靶RNA内腺苷的第二错配。
15.如权利要求14所述的重组表达系统，其中，所述esgRNA的短延伸序列还包含针对所述靶RNA内腺苷的第三错配，以及任选地针对所述靶RNA内腺苷的第四错配。
16.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其中，所述esgRNA的短延伸序列的长度为约15个核苷酸至约60个核苷酸。
17.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其中，所述esgRNA还包含标志物序列。
18.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其中，所述esgRNA还包含RNA聚合酶III启动子序列。
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