[发明专利]CAS转基因小鼠胚胎干细胞和小鼠及其应用

权利要求书

1.一种测试CRISPR/Cas核酸酶体内修饰目标基因组基因座的能力的方法，其包括：

(a)向小鼠内引入设计为靶向目标基因组基因座处的向导RNA靶向序列的向导RNA，

其中，所述小鼠在其种系中的Rosa26基因座处包括基因组整合的Cas9表达盒，

其中所述Cas9表达盒包含Cas9蛋白质的编码序列，其中所述Cas9蛋白质包含在SEQ IDNO:19中列出的完整序列；并且

其中，所述向导RNA通过腺相关病毒(AAV)-介导的递送被引入；以及

(b)评价对目标基因组基因座的修饰。

2.如权利要求1所述的方法，其中，AAV是AAV7,AAV8,或AAV9，并且，步骤(b)包括评价对肝脏中的目标基因组基因座的修饰。

3.如权利要求2所述的方法，其中，AAV是AAV8。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，将AAV给药于所述小鼠的途径是静脉内注射，脑实质内注射，腹膜内注射，鼻灌注或玻璃体内注射。

5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)中引入外源供体核酸，其中，所述外源供体核酸被设计为与所述目标基因组基因座重组。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述外源供体核酸是单链寡脱氧核苷酸(ssODN)。

7.如权利要求1-3和6中任一项所述的方法，其中，所述目标基因组基因座包括目标基因，并且步骤(b)包括测量目标基因的表达或由目标基因编码的蛋白质的活性。

8.如权利要求1-3和6中任一项所述的方法，其中，步骤(b)包括对分离自所述小鼠的一种或多种细胞中的目标基因组基因座进行测序。

9.如权利要求1-3和6中任一项所述的方法，其中，步骤(b)包括从所述小鼠中分离目标器官或组织并且评价对所述目标器官或组织中的目标基因组基因座的修饰。

10.如权利要求9所述的方法，其中，步骤(b)包括评价对所述目标器官或组织中的两种或多种不同的细胞类型中的目标基因组基因座的修饰。

11.如权利要求1-3、6和10中任一项所述的方法，其中，步骤(b)包括从所述小鼠中分离非目标器官或组织并且评价对所述非目标器官或组织中的目标基因组基因座的修饰。

12.如权利要求1-3、6和10中任一项所述的方法，其中，所述Cas9表达盒还包括所述Cas9蛋白质的编码序列上游的聚腺苷酸化信号，其中，所述聚腺苷酸化信号的侧面具有重组酶识别位点，并且，其中，所述Cas9表达盒中的聚腺苷酸化信号以组织特异性的方式被删除。

13.如权利要求12所述的方法，其中，在肝脏中已删除了所述Cas9蛋白质的编码序列上游的聚腺苷酸化信号。

14.如权利要求12所述的方法，其中，识别所述Cas9表达盒中的所述重组酶识别位点的重组酶是Cre重组酶。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述小鼠还包含基因组整合的Cre重组酶表达盒，所述Cre重组酶表达盒包含可操作地连接至组织特异性启动子的Cre重组酶编码序列。

16.如权利要求14或15所述的方法，其中，所述Cre重组酶基因可操作地连接至表2列出的启动子中的一个。