[发明专利]一种索玛鲁肽的合成方法

权利要求书

1.一种索玛鲁肽的合成方法，其特征在于，其步骤包括：

(1)固相合成索玛鲁肽主序列的第1-31位氨基酸，第10位Val与第11位Ser采用Fmoc-Val¹⁰-Ser¹¹(Psi(Me，Me)pro)-OH；第20位Lys侧链采用Fmoc-Lys(X)-OH，X选自：Alloc，Dde，ivdde，Mtt，Octadecanedioic Acid(OtBu)-γ-Glu-OtBu-PEG-PEG-OH；

(2)当Lys²⁰的侧链为Alloc、Dde、ivdde、Mtt时，需要先脱去这些保护基团后偶联Octadecanedioic Acid(OtBu)-γ-Glu-OtBu-PEG-PEG-OH；

(3)经裂解沉淀得到索玛鲁肽粗肽；

(4)索玛鲁肽粗肽经纯化得到索玛鲁肽。

2.根据权利要求l所述的一种索玛鲁肽的合成方法，其特征在于：20位Lys的侧链保护基团选用催化氢化脱除AllocAlloc，Dde，ivdde或者Mtt。

3.根据权利要求1所述的一种索玛鲁肽的合成方法，其特征在于：裂解采用的裂解试剂为TFA∶Thioanisole∶Anisole∶EDT∶H₂O＝90∶3∶3∶2∶2。

4.根据权利要求1所述的一种索玛鲁肽的合成方法，其特征在于：固相合成索玛鲁肽主序列时，采用Fmoc-Gly-Wang树脂，其制备方法如下：

取Wang树脂加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂，抽干溶剂；加Fmoc-Gly-OH、HOBt到DMF溶液中搅拌溶解，降温到5～8℃后，加入DIC溶液搅拌，将活化后的溶液加入到树脂中搅拌反应4-6h；抽干溶剂，加入醋酸酐，吡啶，DMF，封闭1.5-2.5h；DCM与甲醇交替洗涤，真空干燥后，得到Fmoc-Gly-Wang树脂。

5.根据权利要求1所述的一种索玛鲁肽的合成方法，其特征在于：所述的Fmoc-Val¹⁰-Ser¹¹(Psi(Me，Me)pro)-OH的制备方法如下：

(1)Fmoc-Val-Ser-Obzl的制备：

取Fmoc-Val-OH、HOBt溶于DCM中，加DIC反应；取H-Ser-OBzl·HCl，溶于DCM中，滴加DIEA；记为溶液A；14℃-16℃滴加溶液A，14℃-16℃反应4-5小时；过滤得固体，DCM洗涤；30～50℃真空干燥，得固体；

(2)Fmoc-Val-Ser(PsiMe，MePro)-OBzl的制备：

取Fmoc-Val-Ser-Obzl、对甲苯磺酸溶于DCM中，升温至30℃，加2，2-二甲氧基丙烷，升温至60℃，回流30～40min后，蒸馏；将反应液倒入饱和NaHCO₃溶液中，搅拌，过滤，所得液体静置分层；加入无水乙醇，冷却至室温加晶种，继续降温至15℃，结晶；滤出固体；40℃真空干燥，得固体；

(3)Fmoc-Va110-Ser11(Psi(Me，Me)pro)-OH的制备：

将Fmoc-Val-Ser(PsiMe，MePro)-OBzl溶于THF中，加入钯碳，氢气置换；加氢反应1.5-2.5小时，滤除钯碳，加入乙酸乙酯，升温至回流，冷却至30℃加入晶种，降温至17℃结晶；滤出固体，35℃真空干燥，得固体。

6.根据权利要求1-5中任何一项所述的一种索玛鲁肽的合成方法，其特征在于：其具体步骤如下：

(1)全保护肽的制备

称取Fmoc-Gly-Wang树脂，加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂；抽干溶剂，加入哌啶/DMF溶液，反应；抽干溶剂，加入DMF洗涤；茚检结果呈阳性；

取Fmoc-Arg(Pbf)-OH，HOBt，DIC，加入DMF溶解，冰浴活化；将活化后的溶液加入到反应器中，反应；茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；

重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val¹⁰-Ser¹¹(Psi(Me，Me)pro)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Boc-His(Trt)-OH、进行偶联反应；

取四三苯基膦钯，吗啡啉，THF加入到固相反应器中，反应2-4h，DMF洗涤，茚检结果呈阳性；

取Octadecanedioic Acid(OtBu)-γ-Glu-OtBu-PEG-PEG-OH，HOBt，DIC加入DMF溶解，冰浴活化；将活化后的溶液加入到反应器中，反应2-4h，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤，DCM与甲醇交替洗涤，真空干燥；

(2)裂解

配制裂解试剂为TFA∶Thioanisole∶Anisole∶EDT＝90∶2.5∶2.5∶5，冰浴条件下加入到全保护肽中，0.4-0.6h后恢复至室温继续反应2-3h，反应结束后，加入无水乙醚沉淀；加入乙醚离心沉淀；粗肽干燥；

(3)索玛鲁肽的纯化

样品处理：将索玛鲁肽粗品样品溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤；收集过滤后的索玛鲁肽粗肽水溶液备用；

第一步HPLC纯化

色谱条件：以碳十八烷基硅烷键合硅胶填料固定相50mm×250mm，10μm为色谱柱；以0.2％高氯酸为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为50mL每分钟；检测波长为230nm；按以下洗脱梯度进行洗脱：

收取纯度大于90％的索玛鲁肽样品的馏分；用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈；得到索玛鲁肽第一步样品溶液；

第二步HPLC纯化

色谱条件：以碳十八烷基硅烷键合硅胶填料固定相50mm×250mm，10μm为色谱柱；以0.1％三氟乙酸溶液为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为50mL每分钟；检测波长为230nm；按以下洗脱梯度进行洗脱：

收取纯度大于99.5％的索玛鲁肽样品的馏分；用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得索玛鲁肽。