[发明专利]一种用于鉴定水稻对恶苗病抗性的瞬时表达载体在审
| 申请号： | 201811653506.7 | 申请日： | 2018-12-29 |
| 公开（公告）号： | CN109609543A | 公开（公告）日： | 2019-04-12 |
| 发明（设计）人： | 米铁柱;张国栋;刘佳音;吴洁芳;李继明;葛序娟 | 申请（专利权）人： | 青岛袁策集团有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/82 | 分类号： | C12N15/82;C12N15/11;A01H5/00;A01H6/46 |
| 代理公司： | 北京华仁联合知识产权代理有限公司 11588 | 代理人： | 李冰 |
| 地址： | 266000 山东省青岛市李*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 瞬时表达 恶苗病 克隆位点 构建 水稻 空载体 抗性 赤霉素生物合成 鉴定技术 抗性筛选 品种基因 相关基因 载体构建 高通量 农杆菌 双酶切 申请 | ||
1.一种用于鉴定水稻对恶苗病抗性的瞬时表达载体，其特征在于，所述表达载体的制备方法包括：SEQ ID NO.1所示序列通过5’EcoRI和3’HindIII克隆至载体pCAMBIA2300获得。
2.一种用于鉴定水稻对恶苗病抗性的瞬时表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)人工合成赤霉素生物合成相关基因的cDNA片段：在cDNA片段序列中5’端加入克隆位点EcoRI和3’端加入克隆位点HindIII；
(2)pCAMBIA2300瞬时表达载体构建：将pCAMBIA2300空载体进行双酶切，通过T4DNA连接酶将空载体pCAMBIA2300和步骤(1)中的加入克隆位点后的cDNA片段进行连接，构建pCAMBIA2300瞬时表达载体。
3.根据权利要求2所述用于鉴定水稻对恶苗病抗性的瞬时表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，使用的引物序列为：
FFUJ_03408-F：
FFUJ_03408-R：
4.一组用于鉴定水稻对恶苗病抗性的瞬时表达载体构建中使用的引物序列，其特征在于，所述引物序列为：
FFUJ_03408-F：
FFUJ_03408-R：
5.根据权利要求2所述用于鉴定水稻对恶苗病抗性的瞬时表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，pCAMBIA2300表达载体的双酶切反应体系包括：
6.根据权利要求2所述用于鉴定水稻对恶苗病抗性的瞬时表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，双酶切后的pCAMBIA2300表达载体连接，其连接反应体系包括：
7.根据权利要求2所述用于鉴定水稻对恶苗病抗性的瞬时表达载体的构建方法，其特征在于，所述方法进一步包括：
(3)瞬时表达载体建立后的转化和验证。
8.根据权利要求7所述用于鉴定水稻对恶苗病抗性的瞬时表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，转化过程进一步包括：构建好的pCAMBIA2300：FFUJ_03408瞬时表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞DH5d中，在37℃恒温箱中培养12-14h。
9.根据权利要求7所述用于鉴定水稻对恶苗病抗性的瞬时表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，验证的过程进一步包括：在感受态细胞中随机挑选4-6个白色菌落接到LB液体培养基中，在37℃，180r/min的恒温摇床中震荡培养过夜，摇菌结束后，挑取1μL菌液作为模板进行PCR扩增，并将扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，通过挑取有目的片段插入的样品进行质粒提取，用于农杆菌的转化。
10.根据权利要求7所述用于鉴定水稻对恶苗病抗性的瞬时表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，瞬时表达载体的验证体系进一步包括：
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