[发明专利]一种高表达SOD3的CHO细胞株构建方法及SOD3蛋白纯化方法

权利要求书

1.一种高表达SOD3的CHO细胞株构建方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

一、将SEQ ID NO.1所示SOD3的核苷酸序列连接到PUC57克隆载体上构建表达SOD3基因的慢病毒载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-SOD3-Puro；

二、将慢病毒载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-SOD3-Puro和包装质粒psPAX2、pMD2.0G共转染293T细胞，包装成携带SOD3编码基因的慢病毒；

三、将携带SOD3编码基因的慢病毒感染CHO细胞，并经过嘌呤霉素筛选后得到表达SOD3蛋白的CHO细胞群后，再用有限稀释法进一步将上述嘌呤霉素筛选后的表达SOD3蛋白的CHO细胞进行筛选得到稳定的SOD3+CHO细胞株。

2.根据权利要求1所述的高表达SOD3的CHO细胞株构建方法，其特征在于所述扩增测序中，引物设计如下：

EcoRI-上游引物：CGGAATTCATGCTGGCGCTACTGTGTTCC；

NotI-下游引物：TTGCGGCCGCTCAGCGCAGTTCCCACCACT。

3.根据权利要求1所述的高表达SOD3的CHO细胞株构建方法，其特征在于所述将携带SOD3编码基因的慢病毒感染CHO细胞的具体步骤如下：293T细胞释放携带SOD3编码基因的慢病毒，收集上清，超高速离心浓缩后，用慢病毒液感染CHO细胞。

4.根据权利要求1所述的高表达SOD3的CHO细胞株构建方法，其特征在于所述筛选CHO细胞的方法如下：用含嘌呤霉素的选择培养基筛选整合入SOD3的CHO细胞群，然后有限稀释法铺96孔板，通过点杂交和蛋白质免疫印迹法进一步筛选出能够高效表达SOD3蛋白的阳性CHO细胞株，将得到的阳性CHO细胞株进行悬浮发酵培养。

5.一种SOD3蛋白纯化方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

一、将SEQ ID NO.1所示SOD3的核苷酸序列连接到PUC57克隆载体上构建表达SOD3基因的慢病毒载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-SOD3-Puro；

二、将慢病毒载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-SOD3-Puro和包装质粒psPAX2、pMD2.0G共转染293T细胞，包装成携带SOD3编码基因的慢病毒；

三、将携带SOD3编码基因的慢病毒感染CHO细胞，并经过嘌呤霉素筛选后得到表达SOD3蛋白的CHO细胞群后，再用有限稀释法、Western blot方法进一步将上述嘌呤霉素筛选后的表达SOD3蛋白的CHO细胞进行筛选得到稳定的SOD3+CHO细胞株；

四、对得到的SOD3+CHO细胞株进行扩增、分泌型SOD3蛋白分离、纯化，得到纯酶形式的SOD3蛋白。

6.根据权利要求5所述的SOD3蛋白纯化方法，其特征在于所述扩增测序中，引物设计如下：

EcoRI-上游引物：CGGAATTCATGCTGGCGCTACTGTGTTCC；

NotI-下游引物：TTGCGGCCGCTCAGCGCAGTTCCCACCACT。

7.根据权利要求5所述的SOD3蛋白纯化方法，其特征在于所述将携带SOD3编码基因的慢病毒感染CHO细胞的具体步骤如下：293T细胞释放携带SOD3编码基因的慢病毒，收集上清，超高速离心浓缩后，用慢病毒液感染CHO细胞。

8.根据权利要求5所述的SOD3蛋白纯化方法，其特征在于所述筛选CHO细胞的方法如下：用含嘌呤霉素的选择培养基筛选整合入SOD3的CHO细胞群，然后有限稀释法铺96孔板，通过点杂交和蛋白质免疫印迹法进一步筛选出能够高效表达SOD3蛋白的阳性CHO细胞株，将得到的阳性CHO细胞株进行悬浮发酵培养。

9.根据权利要求5所述的SOD3蛋白纯化方法，其特征在于所述步骤四分离、纯化的具体步骤如下：对得到的SOD3+CHO细胞株的分泌蛋白进行超滤、硫酸铵沉降、离子交换层析和凝胶层析纯化，得到纯酶形式的SOD3蛋白。