[发明专利]一种特异性检测水稻稻曲病菌的方法及其应用

说明书

本发明涉及“一种特异性检测水稻稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)的方法及其应用”，属于植物保护领域。该SSR标记是根据Seq ID No.1所示的序列设计的正反向引物，如Seq ID No.2和Seq ID No.3所示，可为PCR技术检测水稻稻曲病菌提供多种引物选择。其步骤如下：(1)制备待测DNA模板；(2)预备含有所述待测DNA模板的PCR反应体系；(3)进行PCR反应及结果观察。本发明设计的高特异性引物具有检测灵敏度高，特异性好的特点，可将水稻稻曲病菌从众多相似的菌株中鉴别出来，为植保工作人员提供可靠的预报参数，以便于及时采取合理的防治措施。

技术领域

本发明属于植物保护领域，是一种涉及特异性检测水稻稻曲病菌的PCR方法及其应用。

技术背景

水稻稻曲病是由稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)侵染引起的一种水稻穗部真菌病害。该病害在世界各水稻产区均有发现，已经成为世界性水稻病害。近年来，随着优质高产水稻的选育和推广、施肥量增加、气候变暖等因素的影响，稻曲病菌呈现发生范围扩大的趋势，逐渐由水稻次生病害发展为主要病害。稻曲病的发生会造成稻穗空秕率增加，千粒重下降；同时，其形成的稻曲球中含有稻曲毒素，能强烈抑制微管蛋白组装，干扰细胞骨架形成，引起人畜病变。因此，稻曲病的发生严重影响到粮食安全，防控稻曲病任重而道远。

目前对于稻曲病菌的研究有很多局限。稻曲病菌的初侵染源和侵染循环还不明晰，而且该病害具有潜伏侵染的特性，在病菌侵入水稻早期不易被发现，难以界定初侵染的时期和规模，直至水稻开花后在稻穗上出现稻曲球症状，才说明该水稻在开花之前被稻曲病菌侵染，而对于未显症的水稻植株还无法判断是否存在稻曲病菌侵染。另一方面，稻曲病菌生长十分缓慢，采用植物组织内生真菌分离法，对未显症状水稻植株体内稻曲病菌分离检测及稻株内分布的研究比较困难。多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)与传统显微观察和病害分离鉴定相比，具有简单快速、准确高效的有点。因此，研发以PCR技术为基础的稻曲病菌监测和鉴定技术，对提高稻曲病菌的预报预测和探索稻曲病菌的侵染循环具有重要意义。

目前，已经有报道应用于PCR检测的特异性靶标位点主要有ITS(InternalTranscribed Spacer)、IGS(Inter-genic spacer)、rDNA、mtDNA(mitochondrial DNA)、SSR(simple sequence repeat)、SCAR(sequence characterized amplified region)等，针对不同的检测对象和检测要求，所选取的特异性把位点也不同。其中SSR又称短串联重复序列或简单重复序列，是一类广泛存在于原核、真核生物基因组中的串联重复DNA，其核心序列一般为由1-6个核苷酸为单位的重复序列，侧翼序列一般是相对保守的单拷贝序列。与其他分子标记相比，SSR具有数量丰富、多态信息含量高、按照孟德尔方式遗传、呈共显性等特点。而且PCR检测SSR标记易于操作，对DNA质量要求不高，并且用量不大，甚至DNA轻度降解后，仍能扩增出目的的SSR序列。SSR标记已经应用于小麦秆锈病菌(Puccinia graminisf.sp.tritici)、小麦条锈病菌(Puccinia striiformis)等病原菌的特异性检测。

在稻曲病菌的特异性分子诊断检测中，已经报道的特异性靶标位点有ITS、rDNA和SCAR等，但国内外尚未见基于SSR方法获得特异性引物检测水稻稻曲病菌的报道。申请人在前期研究中利用MISA分析了稻曲病菌全基因组中SSR位点，并通过Primer 3设计了部分位点的扩增引物(Gene，585：28-34)。但研究仅筛选了稻曲病菌的多态性引物，未对稻曲病菌特异性的SSR标记进行研究。

发明内容

本发明根据上述领域的空白和需求，结合申请人前期研究，提供一种稻曲病菌特异性检测的引物用于检测稻曲病菌，具有特异性好、灵敏度高、操作简单快速的特点。

一对稻曲病菌的特异性检测引物，其扩增的核苷酸序列如SSR-527所示。