[发明专利]鸭瘟病毒gE基因ET区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔET及其构建方法在审
| 申请号： | 201811597285.6 | 申请日： | 2018-12-26 |
| 公开（公告）号： | CN109576293A | 公开（公告）日： | 2019-04-05 |
| 发明（设计）人： | 汪铭书;刘田;黄雅琳;程安春;秦旭东 | 申请（专利权）人： | 四川农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/63 | 分类号： | C12N15/63;C12N7/01;C12R1/93 |
| 代理公司： | 成都正华专利代理事务所(普通合伙) 51229 | 代理人： | 郭艳艳;傅晓 |
| 地址： | 611130 四*** | 国省代码： | 四川;51 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 鸭瘟病毒 构建 无痕 碱基 细菌人工染色体 残留 减毒活疫苗 大肠杆菌 方案解决 基因功能 技术支持 同源重组 拯救系统 上经 外源 位点 质粒 基因 | ||
1.鸭瘟病毒gE基因ET区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔET的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将pBAC-DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中，获得GS1783-pBAC-DPV菌株，然后制备GS1783-pBAC-DPV感受态；
(2)以pEPkan-S为模板，以GS1783-BAC-gEΔET-F和GS1783-BAC-gEΔET-R作为引物，通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及gE基因ET区域上游和下游各40bp同源臂的打靶片段I_SceI-Kana-ET，切胶回收获得I_SceI-Kana-ET片段；
(3)将I_SceI-Kana-ET片段转化到GS1783-pBAC-DPV感受态中，筛选，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ET-Kana；
(4)将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ET-Kana中的I_SceI-Kana片段去掉，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-gEΔET；
(5)从阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-gEΔET中提取pBAC-DPV-gEΔET质粒，将pBAC-DPV-gEΔET质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得gE基因ET区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔET。
2.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒gE基因ET区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔET的构建方法，其特征在于，步骤(2)中引物序列为：
GS1783-BAC-gEΔET-F:5’-CTGCCGGCCAGACTACGGAACCTCAACAATTGGTACGATGtagggataacagggtaatcgattt-3’。；
GS1783-BAC-gEΔET-R:5’-TAATAGTCACGACCCCTAGTACTCCGAGACCGACTACAAACATCGTACCAATTGTTGAGGTTCCGTAGTCTGGCCGGCAGgccagtgttacaaccaat-3’。
3.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒gE基因ET区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔET的构建方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增体系为：ddH2O 22μl、 Max DNAPolymerase 25μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板1μl。
4.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒gE基因ET区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔET的构建方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30个循环，最后72℃延伸10min。
5.采用权利要求1-4任一项所述的方法构建得到的鸭瘟病毒gE基因ET区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔET。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于四川农业大学，未经四川农业大学许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201811597285.6/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
