[发明专利]基于卡他莫拉菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸的制备方法

权利要求书

1.一种卡他莫拉菌表面蛋白M35+McaP，其特征在于：所述卡他莫拉菌表面蛋白M35+McaP的蛋白质序列是：

MEDTNESGLNSNTSRIGFKGSEALNANTDVVYQLEYKIDIDADRGDNFKSRDTYLGLAHKQYGTLLAGRLTTIDDSVDFASMLEDNNVADIGPTFNAPRANNAFAYVSPEYNGTQFLAMYAFDSDTDKGGLAKDDQFGVGATYSTGPINAGATYIHYGDDSHIRLGGSGGSGGSGGSQDYHLSDSITADVKQTGIGLYHRHDFDHLRISANLGVDHLSTQSLRQIMWDGENRNHQAHATGQRRYASVQGSYGFTQNNVTYRPYVGIHAQDIKQNRFFENQPNLSTALSFKLPDHQSLQADIGVNIDYAMNDKLNLLAGLGYQHEFKDNNKTVETAVLSNRDYHRSFVTTVPFDKKHTTHAHLGATLALGNNTHL；

用于编码卡他莫拉菌表面蛋白M35+McaP的蛋白质的基因全序列是：

2.一种用于制备如权利要求1所述的卡他莫拉菌表面蛋白M35+McaP的方法，其特征在于：所述方法是：

获取卡他莫拉菌表面蛋白M35及表面蛋白McaP胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列；优化肽段基因编码序列，并将优化后的肽段基因编码序列用柔性连接肽的编码序列进行连接，形成融合基因；

所述卡他莫拉菌表面蛋白M35及表面蛋白McaP在NCBI蛋白质数据库中的accessionnumber分别为AY905613及EF075940；

所述柔性连接肽的序列是ggsggsggsggs；

同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为m35mac；

所述m35mac的基因全序列是：

所述m35mac基因编码的蛋白质序列是：

MEDTNESGLNSNTSRIGFKGSEALNANTDVVYQLEYKIDIDADRGDNFKSRDTYLGLAHKQYGTLLAGRLTTIDDSVDFASMLEDNNVADIGPTFNAPRANNAFAYVSPEYNGTQFLAMYAFDSDTDKGGLAKDDQFGVGATYSTGPINAGATYIHYGDDSHIRLGGSGGSGGSGGSQDYHLSDSITADVKQTGIGLYHRHDFDHLRISANLGVDHLSTQSLRQIMWDGENRNHQAHATGQRRYASVQGSYGFTQNNVTYRPYVGIHAQDIKQNRFFENQPNLSTALSFKLPDHQSLQADIGVNIDYAMNDKLNLLAGLGYQHEFKDNNKTVETAVLSNRDYHRSFVTTVPFDKKHTTHAHLGATLALGNNTHL；

所述m35mac基因编码的蛋白质序列为卡他莫拉菌表面蛋白M35的50-213aa及表面蛋白McaP的429-625aa；两段蛋白序列中间以柔性连接肽进行连接；将通过柔性连接肽连接得到的基因片段按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+)，转化大肠杆菌TOP10，构建pET-M35mac表达载体，将鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态E.coli BL21(DE3)中，转化完成后将菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，按常规方法筛选表达菌株，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用Ni²⁺亲和层析法纯化重组M35mac蛋白。

3.一种用于制备卡他莫拉菌表面蛋白M35+McaP抗体的方法，其特征在于：所述方法是将如权利要求2所述的重组M35mac蛋白作为免疫抗原，与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔，抽血进行效价测定，分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化，最终获得卡他莫拉菌表面蛋白M35+McaP抗体。