[发明专利]一种犬干扰素的制备方法

说明书

本发明提供了一种犬干扰素的制备方法，该方法通过培养携带犬干扰素基因的重组质粒的大肠杆菌获得种子液，并以一定浓度接种菌液，然后经低温诱导获得发酵菌液，发酵菌液经离心收菌体，菌体经破碎离心收获包涵体，包涵体经洗涤、重悬、低温静水压复性和层析纯化后获得犬干扰素，该方法的优势在于采用低温诱导结合低温静水压复性提高包涵体复性率和蛋白活性。

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体是涉及一种犬干扰素的制备方法。

背景技术

犬干扰素是一种具有较强抗病毒能力的糖蛋白，临床上己经将其用于防治狂犬病，犬细小病毒病，犬瘟热等病毒病。随着分子生物学的迅速发展，利用基因工程的方法体外合成的干扰素已经获得成功。大肠杆菌表达系统因其具备高效、成本低廉等先天优势，成为现有技术中生产犬干扰素蛋白的首要选择，但是由于其表达效率过高、过速，往往使表达的外源蛋白不能正确折叠形成具有正确空间结构和特定生物学功能的蛋白质，表达产物常聚集成直径为0.5-lμm的不可溶的致密的包涵体颗粒。因此将大肠杆菌表达系统表达的犬干扰素用于临床，须进行蛋白复性。现有复性技术中存在较大问题，主要包括：包涵体颗粒结构过于致密，需要用高浓度的裂解剂(常为8M的尿素或6M的盐酸胍)才能使其复溶，而在后期去除裂解剂的过程中，由于难以控制裂解剂的置换速率，常由于环境变化过于剧烈导致复性产物再次聚集失活；此外，为保证复性产物不发生再次聚集失活，在置换裂解剂的过程中常需要大量含有相对低浓度裂解剂的置换液，而大量置换液的引入又会导致过低的复性收率，且由于置换步骤多导致成本高耗时长不适合规模化生产。因此，建立一套降低犬干扰素包涵体的致密程度并在复性过程中引入低浓度的裂解剂的生产工艺，成为解决犬重组干扰素临床应用亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种犬干扰素的制备的方法。

本发明采用低温诱导的方式可降低转录、翻译速率，并减少高温和/或外源蛋白过速表达对宿主菌的毒性。

本发明采用含有β-巯基乙醇或二硫苏糖醇的低浓度尿素重悬液重悬包涵体，既有助于包涵体溶解又能与静水压结合完成复性。

本发明采用低温静水压的方式进行包涵体复性，压力可挤压水分进入包涵体内部、破坏疏水结构，从而达到包涵体蛋白溶解、并进一步解聚成单体的效果，从而提高复性效率。

为实现以上技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种犬干扰素制备方法，其具体步骤为：

一种犬干扰素的制备方法，其特征在于，包括：

1)构建含有犬干扰素基因重组质粒的大肠杆菌，并培养以获取种子液；

2)种子液经扩大培养后在38℃-40℃诱导表达，得到发酵菌液；

3)发酵菌液经破碎、离心后得到包涵体；

4)包涵体经洗涤后，用含β-巯基乙醇或二硫苏糖醇的尿素浓度为2-4mol/L重悬液重悬；

5)将重悬后的包涵体在2-8℃、静水压100-300Mpa的条件下复性，复性产物经层析纯化后得到犬干扰素。

进一步的，步骤4)中所述的重悬液中尿素的浓度为3mol/L。

进一步的，步骤4)中所述的重悬液中β-巯基乙醇或二硫苏糖醇的浓度为0.5-2％。

进一步的，步骤4)中所述的重悬液中β-巯基乙醇或二硫苏糖醇的浓度为1％。

进一步的，步骤5)中将溶解后的包涵体在5℃，静水压200Mpa下复性，得到复性的犬干扰素。

进一步的，步骤5)中所述的复性时长为20小时。

进一步的，步骤2)作为优选可在38℃诱导菌液，得到发酵菌液。